השתלת שתיל מדרגית, גמישה וחסכונית
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת השתלת שתילים חזקה שאינה דורשת ניסיון או הכשרה קודמים וניתן לבצע אותה בעלות נמוכה מאוד תוך שימוש בחומרים הנגישים בקלות ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.
Abstract
השתלת שתילים בשלב מוקדם הפכה לכלי פופולרי בגנטיקה מולקולרית לחקר יחסי שורשים-נבטים בתוך צמחים. השתלת שתילים בשלב מוקדם של צמח המודל הקטן, Arabidopsis thaliana, היא מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן רב בשל גודלם ושבריריותם של שתיליו. אוסף הולך וגדל של שיטות שפורסמו מתארות טכניקה זו עם שיעורי הצלחה משתנים, קושי ועלויות נלוות. מאמר זה מתאר הליך פשוט להכנת מכשיר השתלה לשימוש חוזר פנימי באמצעות תערובת אלסטומרים מסיליקון, וכיצד להשתמש במכשיר זה להשתלת שתילים. בזמן פרסום זה, כל מכשיר השתלה לשימוש חוזר עולה רק $0.47 בחומרים מתכלים לייצר. באמצעות שיטה זו, מתחילים יכולים לקבל שתילים מוצלחים הראשונים שלהם בתוך פחות מ 3 שבועות מתחילתו ועד סופו. הליך נגיש זה יאפשר למעבדות גנטיקה מולקולרית של צמחים לבסס השתלת שתילים כחלק נורמלי מתהליך הניסוי שלהם. בשל השליטה המלאה שיש למשתמשים ביצירה ועיצוב של מכשירי השתלה אלה, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לשימוש בצמחים גדולים יותר, כגון עגבניות או טבק, אם תרצה בכך.
Introduction
השתלה היא טכניקת גננות עתיקה שהפכה לפרקטיקה חקלאית מבוססת בשנת 500 לפנה”ס1. השתלת זנים שונים של צמחי יבול לשיפור היבול הייתה השימוש הראשון בטכניקה זו, וממשיכה לשמש למטרה זו כיום. בעשור האחרון, השתלה משכה כמות הולכת וגדלה של תשומת לב ככלי עבור ביולוגים מולקולריים לחקור איתות למרחקים ארוכים בצמחים 2,3,4,5. בעוד שהשתלת צמחים בוגרים היא קלה יחסית, השתלת צמחים זמן קצר לאחר הנביטה היא מאתגרת. למרות זאת, לעיתים נדרש להעריך את ההשפעות של איתות למרחקים ארוכים בתהליכים כגון התפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ופריחה 6,7,8.
Arabidopsis thaliana נקבע כאורגניזם מודל בביולוגיה של צמחים מסיבות רבות, כולל גודלו הקטן יחסית, מה שהופך אותו קל לגדול בתוך מעבדה. עם זאת, גודלם הקטן ושבריריותם של שתילי ארבידופסיס הופכים את השתלת שתילים צעירים למאתגרת מאוד. במקרים רבים, נדרשת הכשרה מעשית נרחבת כדי להשיג בהצלחה שתלי שתילים. במהלך השנים חלו שיפורים מתודולוגיים רבים שזיהו תנאי גידול אידיאליים וטכניקות חדשות להגדלת שיעור ההצלחה של השתלת שתילים 9,10,11. הכלי האחרון שהוצג היה שבב השתלת שתיל Arabidopsis, המאפשר גם למשתמשים חסרי ניסיון להשיג רמות מקובלות של הצלחת השתלה12. בעוד התקדמות זו הורידה משמעותית את המחסום הטכני של השתלת שתילים, מכשיר השבב יקר, ומספר השתלים שניתן לבצע במקביל הופך במהירות ליקר ביותר.
בנוסף, מכשיר זה יכול לשמש רק עבור שתילי Arabidopsis שיש להם ממדים hypocotyl הדומים שתילים מסוג בר. בעוד ארבידופסיס הוא מין אבן היסוד בעולם הגנטיקה המולקולרית של הצמח, לאחרונה נעשתה עבודה במינים אחרים באמצעות השתלת שתילים. דוגמאות לכך כוללות השתלת פולי סויה והשעועית הנפוצה, טבק לעגבנייה וקנולה לארבידופסיס, ולאחר מכן דגימת שתי הרקמות עבור רנ”א קטן13,14. לכן, שיטת השתלה הנגישה לרוב המעבדות וניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של מיני צמחים ללא שינויים משמעותיים בטכניקה היא רצויה ביותר.
פרוטוקול זה מפרט שיטה המשתמשת בייצור פנימי של מכשיר השתלה פשוט המאפשר התאמה אישית מלאה של קוטר ואורך תעלת השתלה כדי להתאים לכל מורפולוגיית שתיל ברוב מיני הצמחים. הייצור של מכשירים אלה הוא זול מאוד מדרגי מאוד, כמו הרכיבים היחידים הדרושים הם אלסטומר סיליקון, חיווט או צינורות בגודל הנכון, להב דיוק גבוה, מיכל לשמש תבנית. בעקבות פרוטוקול ההשתלה המפורט כאן, משתמשים יכולים להשיג שיעורי השתלה מוצלחים של 45% (n = 105), בדומה לתוצאות ההשתלה שדווחו בעבר10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
סיכום ומשמעות
יצירת איחוד שתלים היא קריטית להשתלה מוצלחת, הדורשת מגע ישיר ובלתי מופרע בין השורש לסיון. הגודל המיניאטורי והשבריריות של שתילים של צמחים קטנים כגון Arabidopsis עושה את זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לענות על דרישה זו. טכניקה אחת שפותחה בשיטות השתלת שתיל ארבידופסיס ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה לחבייר ברומוס על ההכשרה הראשונית וההדרכה בהשתלת שתילי ארבידופסיס .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
