Injerto de plántulas escalable, flexible y rentable
Summary
Este protocolo describe un método robusto de injerto de plántulas que no requiere experiencia previa o capacitación y puede ejecutarse a un costo muy bajo utilizando materiales fácilmente accesibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.
Abstract
El injerto de plántulas en etapa temprana se ha convertido en una herramienta popular en genética molecular para estudiar las relaciones raíz-brote dentro de las plantas. El injerto de plántulas en etapa temprana de la pequeña planta modelo, Arabidopsis thaliana, es técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo debido al tamaño y la fragilidad de sus plántulas. Una creciente colección de métodos publicados describe esta técnica con diferentes tasas de éxito, dificultad y costos asociados. Este documento describe un procedimiento simple para hacer un dispositivo de injerto reutilizable interno utilizando mezcla de elastómero de silicona, y cómo usar este dispositivo para el injerto de plántulas. En el momento de esta publicación, cada dispositivo de injerto reutilizable cuesta solo $ 0.47 en materiales consumibles para producir. Usando este método, los principiantes pueden tener sus primeras plántulas injertadas con éxito en menos de 3 semanas de principio a fin. Este procedimiento altamente accesible permitirá a los laboratorios de genética molecular de plantas establecer el injerto de plántulas como una parte normal de su proceso experimental. Debido al control total que los usuarios tienen en la creación y diseño de estos dispositivos de injerto, esta técnica podría ajustarse fácilmente para su uso en plantas más grandes, como el tomate o el tabaco, si se desea.
Introduction
El injerto es una antigua técnica hortícola que se convirtió en una práctica agrícola establecida por 500 BCE1. El injerto de diferentes variedades de plantas de cultivo para mejorar los rendimientos fue el primer uso de esta técnica, y continúa siendo utilizado para este propósito hoy en día. En la última década, el injerto ha atraído una cantidad creciente de atención como una herramienta para que los biólogos moleculares estudien la señalización a larga distancia en plantas 2,3,4,5. Si bien injertar plantas adultas es relativamente fácil, injertar plantas poco después de la germinación es un desafío. A pesar de esto, a veces se requiere evaluar los efectos de la señalización a larga distancia en procesos como el desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y la floración 6,7,8.
Arabidopsis thaliana se ha establecido como el organismo modelo en biología vegetal por muchas razones, incluyendo su tamaño relativamente pequeño, lo que hace que sea fácil de cultivar dentro de un laboratorio. Sin embargo, el pequeño tamaño y la fragilidad de las plántulas de Arabidopsis hacen que el injerto de plántulas jóvenes sea muy difícil. En muchos casos, se requiere una amplia capacitación práctica para obtener con éxito los injertos de plántulas. Ha habido muchas mejoras metodológicas a lo largo de los años que han identificado condiciones ideales de crecimiento y nuevas técnicas para aumentar la tasa de éxito del injerto de plántulas 9,10,11. La herramienta más reciente introducida fue un chip de injerto de plántulas de Arabidopsis, que permite incluso a los usuarios inexpertos alcanzar niveles aceptables de éxito del injerto12. Si bien este avance ha reducido significativamente la barrera técnica del injerto de plántulas, el dispositivo de chip es costoso y la cantidad de injertos que se pueden realizar en paralelo rápidamente se vuelve prohibitiva.
Además, este dispositivo solo se puede usar para plántulas de Arabidopsis que tienen dimensiones de hipocótilo similares a las plántulas de tipo silvestre. Si bien Arabidopsis es la especie clave en el mundo de la genética molecular de plantas, se han realizado trabajos recientes en otras especies utilizando injertos de plántulas. Los ejemplos incluyen el injerto de soja y frijol común, tabaco a tomate y canola a Arabidopsis, y posteriormente muestreo de ambos tejidos para pequeños ARN13,14. Por lo tanto, un método de injerto que sea accesible para la mayoría de los laboratorios y que pueda adaptarse fácilmente a una amplia gama de especies de plantas sin ningún cambio importante en la técnica es altamente deseable.
Este protocolo detalla un método que emplea la producción interna de un dispositivo de injerto simple que permite la personalización completa del diámetro y la longitud del canal de injerto para acomodar cualquier morfología de plántula en la mayoría de las especies de plantas. La producción de estos dispositivos es muy asequible y altamente escalable, ya que los únicos componentes necesarios son elastómero de silicona, cableado o tubería del tamaño correcto, una cuchilla de alta precisión y un contenedor para servir como molde. Siguiendo el protocolo de injerto detallado aquí, los usuarios pueden lograr tasas de injerto exitosas del 45% (n = 105), comparables con los resultados de injerto informados anteriormente10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resumen y significado
La formación de una unión de injerto es crucial para el injerto exitoso, que requiere un contacto directo y sin interrupciones entre el portainjerto y el vástago. El tamaño en miniatura y la fragilidad de las plántulas de plantas pequeñas como Arabidopsis hacen que sea técnicamente difícil cumplir con este requisito. Una técnica desarrollada en los primeros métodos de injerto de plántulas de Arabidopsis fue insertar tanto el vástago como el portainje…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a Javier Brumos por la formación inicial y la orientación en el injerto de plántulas de Arabidopsis .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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