Skalbar, flexibel och kostnadseffektiv ympning av plantor
Summary
Detta protokoll beskriver en robust ympningsmetod för plantor som inte kräver någon tidigare erfarenhet eller utbildning och kan utföras till en mycket låg kostnad med hjälp av material som är lättillgängliga i de flesta molekylärbiologiska laboratorier.
Abstract
Ympning av plantor i tidigt stadium har blivit ett populärt verktyg inom molekylär genetik för att studera rotskottförhållanden inom växter. Ympning av plantor i tidigt skede av den lilla modellväxten, Arabidopsis thaliana, är tekniskt utmanande och tidskrävande på grund av plantornas storlek och bräcklighet. En växande samling publicerade metoder beskriver denna teknik med varierande framgångsgrad, svårighet och tillhörande kostnader. Detta dokument beskriver ett enkelt förfarande för att göra en intern återanvändbar ympningsanordning med silikonelastomerblandning och hur man använder denna enhet för ympning av plantor. Vid tidpunkten för denna publikation kostar varje återanvändbar ympningsanordning endast $ 0.47 i förbrukningsmaterial att producera. Med hjälp av denna metod kan nybörjare få sina första framgångsrikt ympade plantor på mindre än 3 veckor från början till slut. Detta mycket tillgängliga förfarande gör det möjligt för växtmolekylärgenetiska laboratorier att etablera ympning av plantor som en normal del av deras experimentella process. På grund av den fullständiga kontrollen som användarna har i skapandet och utformningen av dessa ympningsanordningar kan denna teknik enkelt justeras för användning i större växter, såsom tomat eller tobak, om så önskas.
Introduction
Ympning är en gammal trädgårdsteknik som blev en etablerad jordbruksmetod 500 f.Kr.1. Ympning av olika sorter av grödor för att förbättra avkastningen var den första användningen av denna teknik och fortsätter att användas för detta ändamål idag. Under det senaste decenniet har ympning väckt allt större uppmärksamhet som ett verktyg för molekylärbiologer att studera långdistanssignalering i växter 2,3,4,5. Medan ympning av vuxna växter är relativt lätt, är ympning av växter strax efter spiring utmanande. Trots detta är det ibland nödvändigt att bedöma effekterna av långdistanssignalering i processer som växtutveckling, miljörespons och blomning 6,7,8.
Arabidopsis thaliana har etablerats som modellorganism inom växtbiologi av många skäl, inklusive dess relativt lilla storlek, vilket gör det lätt att växa inuti ett labb. Den lilla storleken och bräckligheten hos Arabidopsis-plantor gör dock ympning av unga plantor mycket utmanande. I många fall krävs omfattande praktisk träning för att framgångsrikt få plantor. Det har skett många metodologiska förbättringar genom åren som har identifierat idealiska odlingsförhållanden och nya tekniker för att öka framgångsgraden för ympning av plantor 9,10,11. Det senaste verktyget som introducerades var ett Arabidopsis plantor ympningschip, som gör det möjligt för även oerfarna användare att uppnå acceptabla nivåer av ympningsframgång12. Även om detta framsteg avsevärt har sänkt den tekniska barriären för ympning av plantor, är chipanordningen dyr, och antalet transplantat som kan utföras parallellt blir snabbt kostnadsoöverkomligt.
Dessutom kan denna enhet endast användas för Arabidopsis-plantor som har hypokotyldimensioner som liknar plantor av vildtyp. Medan Arabidopsis är nyckelarten i världen av växtmolekylär genetik, har nyligen arbete gjorts i andra arter med hjälp av plantortransplantation. Exempel inkluderar ympning av sojabönor och den vanliga bönan, tobak till tomat och raps till Arabidopsis, och därefter provtagning av båda vävnaderna för små RNA13,14. Därför är en ympningsmetod som är tillgänglig för de flesta laboratorier och lätt kan anpassas till ett brett spektrum av växtarter utan några större tekniska förändringar mycket önskvärd.
Detta protokoll beskriver en metod som använder intern produktion av en enkel ympningsanordning som möjliggör fullständig anpassning av ympkanalens diameter och längd för att rymma alla plantors morfologi över de flesta växtarter. Produktionen av dessa enheter är mycket prisvärd och mycket skalbar, eftersom de enda komponenterna som behövs är silikonelastomer, ledningar eller rör av rätt storlek, ett blad med hög precision och en behållare för att fungera som en form. Enligt ympningsprotokollet som beskrivs här kan användare uppnå framgångsrika ympningshastigheter på 45% (n = 105), jämförbart med tidigare rapporterade ympningsresultat10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammanfattning och betydelse
Bildandet av en ympförening är avgörande för framgångsrik ympning, vilket kräver direkt och ostörd kontakt mellan grundstammen och scion. Miniatyrstorleken och bräckligheten hos plantor av små växter som Arabidopsis gör det tekniskt utmanande att uppfylla detta krav. En teknik som utvecklades i tidiga Arabidopsis-plantympningsmetoder var att sätta in både scion och grundstammen i en kort silikonslangkrage för att stödja transplantatkorsning…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack till Javier Brumos för inledande utbildning och vägledning i ympning av Arabidopsis-plantor .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
