Ölçeklenebilir, esnek ve uygun maliyetli fide aşılama
Summary
Bu protokol, önceden deneyim veya eğitim gerektirmeyen ve çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca erişilebilen malzemeler kullanılarak çok düşük bir maliyetle yürütülebilen sağlam bir fide aşılama yöntemini açıklamaktadır.
Abstract
Erken evre fide aşılama, bitkilerdeki kök-sürgün ilişkilerini incelemek için moleküler genetikte popüler bir araç haline gelmiştir. Küçük model bitki Arabidopsis thaliana’nın erken aşamadaki fidelerinin aşılanması, fidelerinin büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Yayınlanmış yöntemlerin giderek artan bir koleksiyonu, bu tekniği değişen başarı oranları, zorluk ve ilişkili maliyetlerle tanımlamaktadır. Bu makalede, silikon elastomer karışımı kullanılarak şirket içi yeniden kullanılabilir bir aşılama cihazı yapmak için basit bir prosedür ve bu cihazın fide aşılama için nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu yayın sırasında, her bir yeniden kullanılabilir aşılama cihazı, üretilecek sarf malzemesinde sadece 0,47 $ ‘a mal oluyor. Bu yöntemi kullanarak, yeni başlayanlar ilk başarılı aşılanmış fidelerini baştan sona 3 haftadan daha kısa bir sürede alabilirler. Bu son derece erişilebilir prosedür, bitki moleküler genetik laboratuvarlarının fide aşılamasını deneysel süreçlerinin normal bir parçası olarak kurmalarına izin verecektir. Kullanıcıların bu aşılama cihazlarının oluşturulmasında ve tasarımında sahip oldukları tam kontrol nedeniyle, bu teknik istenirse domates veya tütün gibi daha büyük bitkilerde kullanım için kolayca ayarlanabilir.
Introduction
Aşılama, MÖ 500 yılına kadar yerleşik bir tarım uygulaması haline gelen eski bir bahçecilik tekniğidir1. Verimi artırmak için farklı bitki çeşitlerini aşılamak, bu tekniğin ilk kullanımıydı ve bugün bu amaçla kullanılmaya devam ediyor. Son on yılda, aşılama, moleküler biyologların bitkilerde uzun mesafeli sinyalleşmeyi incelemeleri için bir araç olarak giderek artan miktarda dikkat çekmiştir 2,3,4,5. Yetişkin bitkileri aşılamak nispeten kolay olsa da, çimlenmeden hemen sonra bitkileri aşılamak zordur. Buna rağmen, bazen bitki gelişimi, çevresel tepkiler veçiçeklenme 6,7,8 gibi süreçlerde uzun mesafeli sinyalizasyonun etkilerini değerlendirmek gerekir.
Arabidopsis thaliana, nispeten küçük boyutu da dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı bitki biyolojisinde model organizma olarak kurulmuştur ve bu da bir laboratuarda büyümesini kolaylaştırmaktadır. Bununla birlikte, Arabidopsis fidelerinin küçük boyutu ve kırılganlığı, genç fidelerin aşılanmasını çok zorlaştırır. Çoğu durumda, fide greftlerini başarılı bir şekilde elde etmek için kapsamlı uygulamalı eğitim gereklidir. Yıllar geçtikçe, fide aşılamanın başarı oranını artırmak için ideal yetiştirme koşullarını ve yeni teknikleri belirleyen birçok metodolojik gelişme olmuştur 9,10,11. Tanıtılan en son araç, deneyimsiz kullanıcıların bile kabul edilebilir aşılama başarısı seviyelerine ulaşmalarını sağlayan bir Arabidopsis fide aşılama çipiydi12. Bu ilerleme, fide aşılamasının teknik bariyerini önemli ölçüde azaltmış olsa da, çip cihazı pahalıdır ve paralel olarak yapılabilecek greft sayısı hızla maliyet engelleyici hale gelir.
Ek olarak, bu cihaz sadece yabani tip fidelere benzer hipokotil boyutlarına sahip Arabidopsis fideleri için kullanılabilir. Arabidopsis, bitki moleküler genetiği dünyasında kilit taşı türü olsa da, son zamanlarda fide aşılaması kullanılarak diğer türlerde de çalışmalar yapılmıştır. Örnekler arasında soya fasulyesi ve ortak fasulye, tütünden domatese ve kanoladan Arabidopsis’e aşılama ve daha sonra her iki dokunun da küçük RNA’lar için örneklenmesisayılabilir 13,14. Bu nedenle, çoğu laboratuvar tarafından erişilebilen ve herhangi bir büyük teknik değişiklik yapmadan çok çeşitli bitki türlerine kolayca uyarlanabilen bir aşılama yöntemi oldukça arzu edilir.
Bu protokol, çoğu bitki türünde herhangi bir fide morfolojisini barındırmak için aşılama kanalı çapının ve uzunluğunun tamamen özelleştirilmesine izin veren basit bir aşılama cihazının şirket içi üretimini kullanan bir yöntemi detaylandırır. Bu cihazların üretimi çok uygun fiyatlı ve oldukça ölçeklenebilirdir, çünkü ihtiyaç duyulan tek bileşenler silikon elastomer, doğru boyutta kablolama veya boru, yüksek hassasiyetli bir bıçak ve kalıp görevi görecek bir kaptır. Burada detaylandırılan aşılama protokolünü takiben, kullanıcılar daha önce bildirilen aşılama sonuçları 10,12 ile karşılaştırılabilir olan% 45’lik (n =105) başarılı aşılama oranları elde edebilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Özet ve önem
Greft birliğinin oluşması, anaç ve filiz arasında doğrudan ve kesintisiz temas gerektiren başarılı aşılama için çok önemlidir. Arabidopsis gibi küçük bitkilerin fidelerinin minyatür boyutu ve kırılganlığı, bu gereksinimi karşılamayı teknik olarak zorlaştırmaktadır. Erken Arabidopsis fide aşılama yöntemlerinde geliştirilen bir teknik, greft bileşkesi10’u desteklemek için hem filiz hem de anacı kısa bir silikon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arabidopsis fidelerinin aşılanmasında ilk eğitim ve rehberlik için Javier Brumos’a teşekkür ederiz.
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
