Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden
Summary
Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.
Abstract
Neutrophile fungieren als erste Linie der zellulären Abwehr in einer angeborenen Immunantwort, indem sie verschiedene Mechanismen einsetzen, wie z.B. die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Diese Studie analysiert die morphologischen und kompositorischen Veränderungen in NETs, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden, unter Verwendung standardisierter In-vitro-Methoden für die NET-Induktion und Charakterisierung mit menschlichen Zellen. Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen die Analyse der NET-Morphologie (lytisch oder nicht-lytisch) und der Zusammensetzung (DNA-Proteinstrukturen und enzymatische Aktivität) sowie die Wirkung löslicher Faktoren oder zellulärer Kontakte auf solche Eigenschaften. Zusätzlich könnten die hier beschriebenen Techniken modifiziert werden, um die Wirkung von exogenen löslichen Faktoren oder zellulärem Kontakt auf die NET-Zusammensetzung zu bewerten.
Die angewandten Techniken umfassen die Reinigung von polymorphkernigen Zellen aus menschlichem peripherem Blut unter Verwendung eines doppelten Dichtegradienten (1,079-1,098 g/ml), der eine optimale Reinheit und Lebensfähigkeit (≥ 95%) garantiert, wie die Wright-Färbung, der Trypanblauausschluss und die Durchflusszytometrie, einschließlich FSC- versus SSC-Analyse und 7AAD-Färbung, zeigen. Die NET-Bildung wird mit mikrobiellen (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Candida albicans) und chemischen (Phorbolmyristatacetat, HOCl) Stimuli induziert, und die NETs sind durch DNA-DAPI-Färbung, Immunfärbung für das antimikrobielle Peptid Cathelicidin (LL37) und Quantifizierung der enzymatischen Aktivität (neutrophile Elastase, Cathepsin G und Myeloperoxidase) gekennzeichnet. Die Bilder werden mittels Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen und mit ImageJ analysiert.
Introduction
Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im Blutkreislauf und spielen eine wesentliche Rolle bei der Beseitigung von Krankheitserregern durch verschiedene Mechanismen, einschließlich der Freisetzung großer Chromatinstrukturen, die aus DNA und mehreren nuklearen, zytoplasmatischen und granulären antibakteriellen Proteinen bestehen 1,2. Der direkte Vorläufer, der diese antimikrobielle Rolle von Neutrophilen beschreibt, wurde 1996 von Takei et al.3 erstellt. Diese Autoren berichteten über eine neue Form des Todes, die sich von Apoptose und Nekroptose bei Neutrophilen unterschied, morphologische Veränderungen zeigten, die einen Kernbruch zeigten, gefolgt von einem Austreten aus dem Nukleoplasma in das Zytoplasma und einer Erhöhung der Membranpermeabilität nach 3 Stunden Inkubation mit Phorbolmyristatacetat (PMA)2,3. Es dauerte jedoch bis 2004, bis der Begriff “neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs)” verwendet wurde4.
Die NET-Bildung wurde unter verschiedenen Bedingungen beobachtet, wie z. B. bakteriellen,Pilz-5-,Virus-6– und parasitären Infektionen, um die mikrobielle Verbreitung zu neutralisieren, abzutöten und zu verhindern7. Andere Studien zeigen, dass es auch unter nicht-pathogenen Zuständen durch sterile Reize wie Zytokine, Mononatriumharnsäure- oder Cholesterinkristalle, Autoantikörper, Immunkomplexe und aktivierte Blutplättchen auftretenkann 7. Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-8 (IL-8) und PMA gehörten zu den ersten In-vitro-Stimuli, die als NET-Induktoren beschrieben wurden, und die In-vivo-Beteiligung von NET an pathogenen Prozessen wurde in zwei Modellen akuter Entzündung nachgewiesen: experimentelle Dysenterie und spontane menschliche Appendizitis4. DNA ist eine wesentliche NET-Komponente. Seine geeignete Struktur und Zusammensetzung sind für die Sequestrierung und Abtötung von Mikroorganismen notwendig, indem eine hohe lokale Konzentration antimikrobieller Moleküle an die gefangenen Mikroben abgegeben wird, wie eine kurze Desoxyribonuklease (DNase)-Behandlung zeigt, die NETs und ihre mikrobiziden Eigenschaften zersetzt4. NETs umfassen neben DNA u.a. angehängte Proteine wie Histone, neutrophile Elastase (NE), Cathepsin G (CG), Proteinase 3, Lactoferrin, Gelatinase, Myeloperoxidase (MPO) und antimikrobielle Peptide (AMPs) wie das kationische proinflammatorische Peptid Cathelicidin LL-37 u.a. 8,9. Solche Aggregate können größere Fäden mit Durchmessern von bis zu 50 nm bilden. Diese Faktoren können die mikrobiellen Virulenzfaktoren oder die Integrität der Zellmembran des Erregers stören. zusätzlich können die AMPs die NET-abgeleitete DNA gegen den Abbau durch bakterielle Nukleasenstabilisieren 10.
Die spezifischen Mechanismen, die die NET-Bildung regulieren, sind noch nicht vollständig geklärt. Der am besten charakterisierte Weg, der zur NET-Freisetzung führt, ist der ERK-Signalweg, der zur Aktivierung der NADPH-Oxidase und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie zu erhöhtem intrazellulärem Kalzium führt, das die Aktivierung des MPO-Signalwegs auslöst. Dies wiederum wandelt Wasserstoffperoxid in hypochlorige Säure um und aktiviert NE durch Oxidation11,12. NE ist verantwortlich für den Abbau der Aktinfilamente des Zytoskeletts, um die Phagozytose zu blockieren, und für die Translokation in den Zellkern zur Verarbeitung durch proteolytische Spaltung und Desaminierung durch PAD4, die die Desensibilisierung von Chromatinfasern vorantreiben, die sich mit granulierten und zytoplasmatischen Proteinen verbinden und dann extrazellulär freigesetzt werden7. Zu diesen Proteasen gehören diejenigen, die aus dem Azurosomenkomplex des azurophilen Granulats und anderen Proteasen wie Cathepsin G13 freigesetzt werden.
Abhängig von den morphologischen Veränderungen der Neutrophilen werden NETs in zwei Typen eingeteilt: suizidale oder lytische NET-Bildung, die zum Zelltod führt4, und vitale oder nicht-lytische NET-Bildung, die von lebensfähigen Zellen erzeugt wird, die durch eine vesikuläre Freisetzung von nukleärer oder mitochondrialer DNA vermittelt wird, mit einem Überrest eines kernhaltigen Zytoplasten mit phagozytärer Fähigkeit14,15. Im Allgemeinen weisen NETs, die aus mitochondrialer DNA bestehen, eine länglicheFaser-14-Morphologie auf, während solche, die aus Kern-DNA strukturiert sind, ein wolkenartiges Aussehenaufweisen 3. Es ist jedoch nicht bekannt, wie die Neutrophile ihren DNA-Ursprung wählt. Im Gegensatz zu früheren Studien, die die kanonischen Signalwege von NETs als mehrere Stunden dauernd beschrieben, wird der Vitalweg in nur 5-60 min15 schnell aktiviert.
Trotz dieser Fortschritte variiert die NET-Zusammensetzung je nach Stimulus; Zum Beispiel induzieren verschiedene schleimige und nicht-mukoide Stämme von P. aeruginosa die Bildung von NETs, die 33 gemeinsame Proteine und bis zu 50 variable Proteine enthalten7. Daher ist es notwendig, Techniken zu homogenisieren, die die Generierung objektiver Schlussfolgerungen in Forschungsgruppen ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll mit verschiedenen Techniken, die den Vergleich und die Bewertung der Zusammensetzung, Struktur und Morphologie von NETs ermöglichen, die mit verschiedenen Mikroorganismen induziert werden: Staphylococcus aureus (grampositives Bakterium), Pseudomonas aeruginosa (gramnegatives Bakterium) und Candida albicans (Pilz) sowie chemische Stimuli (PMA, HOCl) in menschlichen Neutrophilen von gesunden Personen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Heterogenität von NETs in Abhängigkeit von ihrem induzierenden Stimulus unter vergleichbaren in vitro Bedingungen, gekennzeichnet durch DNA-DAPI-Färbung, Immunfärbung für LL37 und Quantifizierung der enzymatischen Aktivität (NE, CG und MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Freisetzung von NETs zu induzieren, muss eine hochreine Population lebensfähiger Neutrophilen erhalten werden, da diese Zellen eine begrenzte Ex-vivo-Lebensdauer von durchschnittlich 8 Stunden haben, ein Zeitraum, in dem alle Experimente durchgeführt werden müssen. Zu diesem Zweck ist die ideale Methodik der Double-Density-Gradient zur Optimierung der Reinigungszeit durch Isolierung nicht aktivierter Zellen, die im Gegensatz zu Ficoll-Histopaque-Gradienten- oder Dextran-Sedimentationstechniken besser a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Basic Science Grant (#285480) von CONACyT und von der Abteilung für klinische Immunologieforschung der Fakultät für Biochemische Wissenschaften der Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca unterstützt. A.A.A, S.A.S.L. und W.J.R.R. haben Doktorandenstipendien der CONACyT-Nummern #799779, #660793 bzw. #827788.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
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