Summary

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

T細胞シグナル伝達の尺度であるカルシウム流入は、T細胞受容体刺激に対する応答を分析するための効果的な方法です。Indo-1を細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでマルチプレックス化するためのこのプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーの非常に柔軟な機能を利用しています。

Abstract

T細胞受容体刺激に応答するカルシウム流入は、T細胞シグナル伝達の一般的な尺度である。バンドパスフローサイトメトリーによるカルシウムシグナル伝達を評価するために、いくつかのカルシウム指示色素が開発されています。このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用して初代マウスT細胞のカルシウム応答を測定するように設計されています。全脾細胞は、細胞表面分子に対する蛍光色素結合抗体のパネルとともに、レシオメトリックカルシウム指示色素Indo-1で標識されています。フルスペクトルフローサイトメトリーの機能を活用することで、Indo-1と組み合わせて幅広い細胞表面染色剤を利用するためのプラットフォームが提供されます。次いで、T細胞受容体を刺激する抗CD3抗体の添加前後の37°Cで細胞をリアルタイムで分析する。スペクトルシグナルを混合解除した後、カルシウム結合とカルシウムフリーのインド-1の比率が計算され、脾細胞のゲート集団ごとに経時的に視覚化できます。この技術は、複数の細胞集団におけるカルシウム応答の同時解析を可能にすることができる。

Introduction

T細胞受容体(TCR)誘導性カルシウム流入は、T細胞活性化の有用な尺度であり、T細胞の集団がTCRシグナル伝達経路1の近位ステップで応答を障害しているかどうかを判断するために頻繁に使用されます。カルシウム流入の測定は、一般に、T細胞を1つまたは1対の蛍光カルシウム指示色素で予め標識し、次いでTCR架橋後にフローサイトメトリーを用いて蛍光シグナルをリアルタイムで調べることによって行われる2,3,4レシオメトリックカルシウム色素であるインド-1は、カルシウム結合に依存する2つの異なる波長でピーク発光するUVレーザーによって励起され5、生リンパ球におけるカルシウム応答のフローサイトメトリー分析に一般的に使用される指標色素です。Indo-1の発光プロファイルは非常に広いため、Indo-1評価とバンドパスフローサイトメトリーによる複数の細胞表面マーカーの同時分析を組み合わせることは困難な場合があります。この制限により、カルシウム応答のフローサイトメトリー分析の利用は、T細胞の事前に精製された集団または限られた細胞表面分子のセットによって同定された集団に制限されます。

バンドパスフローサイトメトリーを使用して初代リンパ球の不均一な集団に対するカルシウム応答を測定することの限界に対処するために、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してIndo-1蛍光を測定するためのプロトコルが開発されました。この方法では、フルスペクトルフローサイトメトリーの柔軟性の高い機能を利用して、細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでIndo-1をマルチプレックス化することができます。従来のフローサイトメトリーよりもフルスペクトルフローサイトメトリーを使用する利点は、蛍光シグナルを高度に重なり合う色素から区別できるため、各サンプルで同時に評価できる表面マーカーの数が増えることです。従来のフローサイトメトリーはバンドパスフィルターを使用し、検出器システム6あたり1つの蛍光色素に制限されています。フルスペクトルフローサイトメトリーは、5レーザースペクトルフローサイトメトリーシステム上の64個の検出器を使用して、蛍光色素の全スペクトルにわたってシグナルを収集します7,8。さらに、フルスペクトルフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメーター8に存在する光電子増倍管検出器と比較して感度が向上したAPD(アバランシェフォトダイオード)検出器を利用します。したがって、このアプローチは、カルシウム色素標識の前に特定のT細胞集団を単離する必要がないため、末梢血単核細胞やマウス二次リンパ器官細胞懸濁液などの不均一な細胞集団に最適です。代わりに、データ収集後の細胞表面マーカー発現プロファイルとフローサイトメトリーゲーティングを使用して、関心のある各集団におけるカルシウム応答を評価できます。このレポートで示されているように、Indo-1は8つの蛍光色素結合抗体と容易に組み合わせることができ、合計10のユニークなスペクトルシグネチャが得られます。さらに、この方法は、先天的に異なるマウス系統の細胞の混合物に容易に適用することができ、遺伝子標的マウス株からのものと比較して、野生型T細胞におけるカルシウム応答の同時解析を可能にする。

Protocol

マウスは、IACUCプロトコルに従ってコロラド大学アンシュッツ医科キャンパスで維持された。全てのマウスをAAALAC基準に従って安楽死させた。 1. マウス脾臓からの免疫細胞の調製 注:ナイーブマウスをCO2 安楽死で安楽死させる。ジャクソン研究所から購入し、社内で飼育したC57BL/6マウスを6〜12週齢で実験に使用します。実験には?…

Representative Results

マルチプレックス表面染色を有するIndo-1レシオメトリック色素を用いて初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を評価する実験ワークフローを 図1に示す。マウス脾細胞を回収し、単一細胞懸濁液に加工した後、細胞をIndo-1 AMエステルで染色し、蛍光色素結合抗体で表面染色します。色素の装填と抗体染色が完了したら、リンパ球サンプルを生物学的温度(37°C)まで温め…

Discussion

このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリー7,8を使用して滴定されたIndo-1レシオメトリックインジケーター色素をロードした初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を測定するために設計された最適化されたアッセイについて説明しています。フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してカルシウムフラックスアッセイを実施す?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01AI132419, CU |AMC ImmunoMicro Flow Cytometry共有リソース、RRID:SCR_021321、AuroraおよびSpectroFloソフトウェアでのフルスペクトルサイトメトリー分析の継続的な議論を提供してくれたCytekの同僚に感謝します。図は BioRender.com で作成されました。

Materials

12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

References

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Citer Cet Article
Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

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