Analyse av T-cellereseptorindusert kalsiuminnstrømning i primære Murine T-celler ved fullspektret flowcytometri

Summary

Kalsiuminnstrømning, et mål på T-cellesignalering, er en effektiv måte å analysere responser på T-cellereseptorstimulering. Denne protokollen for multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri.

Abstract

Kalsiuminnstrømning som respons på T-cellereseptorstimulering er et vanlig mål for T-cellesignalering. Flere kalsiumindikatorfargestoffer er utviklet for å vurdere kalsiumsignalering ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne protokollen er utformet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av fullspektret flowcytometri. Totale splenocytter er merket med ratiometrisk kalsiumindikatorfargestoff Indo-1, sammen med et panel av fluorokrom-konjugerte antistoffer mot celleoverflatemolekyler. Utnyttelse av egenskapene til fullspektret flowcytometri gir en plattform for å utnytte et bredt utvalg av celleoverflateflekker i kombinasjon med Indo-1. Cellene analyseres deretter i sanntid ved 37 °C før og etter tilsetning av et anti-CD3-antistoff for å stimulere T-cellereseptoren. Etter å ha blandet spektralsignalene, beregnes forholdet mellom kalsiumbundet og kalsiumfritt Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver inngjerdede populasjon av splenocytter. Denne teknikken kan tillate samtidig analyse av kalsiumresponser i flere cellepopulasjoner.

Introduction

T-cellereseptor (TCR) indusert kalsiuminnstrømning er et nyttig mål på T-celleaktivering og brukes ofte til å avgjøre om en populasjon av T-celler har svekkede responser i de proksimale trinnene i TCR-signalveien¹. Målinger av kalsiuminnstrømning utføres vanligvis ved å forhåndsmerke T-cellene med ett eller et par fluorescerende kalsiumindikatorfargestoffer, og deretter undersøke de fluorescerende signalene ved hjelp av flowcytometri i sanntid etter TCR-kryssbinding ^2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk kalsiumfargestoff, er begeistret av UV-laseren med topputslipp ved to forskjellige bølgelengder avhengig av kalsiumbinding⁵, og er et vanlig brukt indikatorfargestoff for flowcytometrianalyse av kalsiumresponser i levende lymfocytter. Siden emisjonsprofilen til Indo-1 er ganske bred, kan det være utfordrende å kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse av flere celleoverflatemarkører ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne begrensningen begrenser bruken av flowcytometrianalyse av kalsiumresponser til forhåndsrensede populasjoner av T-celler eller til populasjoner identifisert av et begrenset sett med molekyler på celleoverflaten.

For å løse begrensningene ved måling av kalsiumrespons på heterogene populasjoner av primære lymfocytter ved bruk av båndpassflowcytometri, ble det utviklet en protokoll for å måle Indo-1-fluorescens ved bruk av fullspektret flowcytometri. Denne metoden tillater multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler, og utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri. Fordelen med å bruke fullspektret flowcytometri fremfor konvensjonell flowcytometri er evnen til å skille fluorescerende signaler fra sterkt overlappende fargestoffer, og dermed øke antall overflatemarkører som kan vurderes samtidig i hver prøve. Konvensjonell flowcytometri bruker båndpassfiltre og er begrenset til ett fluorokrom per detektorsystem⁶. Full spektrum flowcytometri samler signaler over hele spekteret av fluorokrom ved hjelp av 64 detektorer på et fem-laser spektralt flowcytometrisystem ^7,8. I tillegg utnytter fullspektret flowcytometri APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) som har økt følsomhet i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer som finnes på konvensjonelle strømningscytometre⁸. Følgelig er denne tilnærmingen ideell for heterogene cellepopulasjoner, for eksempel mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensjoner, da det eliminerer behovet for isolering av spesifikke T-cellepopulasjoner før kalsiumfargestoffmerking. I stedet kan ekspresjonsprofiler for celleoverflatemarkører og flowcytometrigating etter datainnsamling brukes til å vurdere kalsiumresponser i hver populasjon av interesse. Som vist i denne rapporten, kan Indo-1 lett kombineres med åtte fluorokrom-konjugerte antistoffer, noe som resulterer i totalt 10 unike spektrale signaturer. Videre kan denne metoden lett brukes på blandinger av celler fra kongenisk distinkte muselinjer, noe som muliggjør samtidig analyse av kalsiumresponser i villtype T-celler sammenlignet med de fra en genmålrettet muselinje.

Protocol

Mus ble opprettholdt ved University of Colorado Anschutz Medical campus i samsvar med IACUC-protokoller. Alle mus ble avlivet i henhold til AAALAC-standarder. 1. Forberedelse av immunceller fra musmilten MERK: Avlive naive mus med CO2 eutanasi. C57BL/6 mus kjøpt fra Jackson Laboratories og avlet internt brukes til eksperimenter ved 6-12 ukers alder. Både hann- og hunnmus brukes til eksperimenter. Desinfiser musehuden med 70% e…

Representative Results

Den eksperimentelle arbeidsflyten for å vurdere kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av et Indo-1-ratiometrisk fargestoff med multipleksende overflateflekker er vist i figur 1. Etter høsting og bearbeiding av musens miltocytter i en enkeltcellesuspensjon, blir cellene farget med en Indo-1 AM-ester og overflatefarget med fluorokrombundne antistoffer. Når fargestoffbelastningen og antistofffargingen er fullført, varmes lymfocyttprøvene opp til en biologisk temperatur (37 ?…

Discussion

Denne protokollen beskriver en optimalisert analyse designet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler lastet med titrert Indo-1 ratiometrisk indikatorfargestoff ved bruk av fullspektret flowcytometri ^7,8. Fordelen med å utføre kalsiumfluksanalyser ved bruk av fullspektret flowcytometri er evnen til å multiplekse overflatecellemarkørfarging i kombinasjon med vurdering av Indo-1-fluorescens. Fullspektret flowcytometri har fordelen av å tillate …

Materials

12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath