إكس فيفو تحليل عابرات الكالسيوم2+ المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية
Summary
يصف هذا البروتوكول منهجية لتقييم وظيفة القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية الأصلية باستخدام مستشعر Ca2+ الفلوري GCaMP5G.
Abstract
القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا هي محولات طاقة بيولوجية تحول المحفزات الميكانيكية مثل قوى التمدد أو القص إلى إشارات كهربائية وكيميائية حيوية. في الثدييات ، تعد القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا ضرورية للكشف عن المحفزات الخارجية والداخلية في عمليات متنوعة مثل الإحساس باللمس والسمع وتنظيم حجم خلايا الدم الحمراء وتنظيم ضغط الدم الأساسي والإحساس بامتلاء المثانة البولية. في حين أن وظيفة القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا قد تمت دراستها على نطاق واسع في الإعداد في المختبر باستخدام تقنية المشبك الرقعي ، فإن تقييم وظيفتها في بيئتها الأصلية لا يزال مهمة صعبة ، غالبا بسبب محدودية الوصول إلى مواقع التعبير عن هذه القنوات (على سبيل المثال ، المحطات الطرفية الواردة ، وخلايا ميركل ، ومستقبلات الضغط ، والأنابيب الكلوية) أو صعوبات تطبيق تقنية المشبك الرقعي (على سبيل المثال ، الأسطح القمية لخلايا مظلة الظهارة البولية). يصف هذا البروتوكول إجراء لتقييم عابري Ca 2+ المستحثين ميكانيكيا باستخدام مستشعر الفلورسنت GCaMP5G في إعداد ظهارة البول خارج الجسم الحي ، وهي تقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أحداث Ca2+ المستحثة ميكانيكيا في مستحضرات الأنسجة الأصلية الأخرى.
Introduction
تتعرض الخلايا الطلائية في المسالك البولية لقوى ميكانيكية أثناء انتقال الراشح البولي عبر النيفرون، ويضخ البول من الحوض الكلوي وينتقل عبر الحالبين لتخزينه في المثانة البولية. من المسلم به منذ فترة طويلة أن القوى الميكانيكية (مثل إجهاد القص والتمدد) التي تمارسها السوائل على الخلايا الظهارية التي تبطن المسالك البولية تنظم إعادة امتصاص البروتين في النبيب القريب والمواد المذابة في النيفرون البعيد1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 ، 12,13 ، وكذلك تخزين البول في المثانة البولية والتبول14,15,16,17.
يتم تحويل المحفزات الميكانيكية إلى إشارات كهربائية وكيميائية حيوية ، وهي عملية يشار إليها باسم النقل الميكانيكي ، بوساطة البروتينات التي تستجيب لتشوه الهياكل الخلوية أو المصفوفة خارج الخلية المرتبطةبها 18،19،20،21. تعتبر القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا فريدة من نوعها بمعنى أنها تنتقل من حالة مغلقة إلى حالة نفاذية مفتوحة استجابة للتغيرات في توتر الغشاء أو الضغط أو إجهاد القص18،19،20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بدء عابرات Ca 2+ عن طريق النقل الميكانيكي بوساطة الانتغرين أو عن طريق تنشيط أنظمة الالتصاق المستجيبة ميكانيكيا عند تقاطعات الخلاياالخلوية 23،24،25،26. عادة ما يتم تقييم وظيفة القناة الأيونية باستخدام تقنية المشبك الرقعة ، والتي تتضمن تكوين ختم جيجا أوم بين غشاء الخلية وماصة التصحيح27. ومع ذلك ، يصعب الوصول إلى الخلايا الموجودة في طبقات الأنسجة العميقة ذات المصفوفة الكثيفة خارج الخلية (مثل الأنابيب الكلوية) أو المحاطة بحاجز مادي (مثل الجليكوكاليكس) باستخدام ماصة زجاجية دقيقة. وبالمثل ، لا يمكن دراسة الخلايا المدمجة أو التي هي أجزاء متكاملة من الأنسجة ذات الاستقرار الميكانيكي الضعيف (على سبيل المثال ، الظهارة البولية) بسهولة باستخدام تقنية المشبك الرقعي. نظرا لأن العديد من القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا قابلة للنفاذ إلى Ca 2+ ، فإن النهج البديل هو تقييم نشاطها بواسطة الفحص المجهري الفلوري باستخدام صبغة حساسة ل Ca2+ أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP. أدت الجهود الأخيرة في هندسة البروتين إلى زيادة كبيرة في النطاق الديناميكي والحساسية والاستجابة ل GECIs28،29،30 ، وقد سمح التقدم في علم الوراثة بالتعبير عنها في مجموعات خلايا معينة ، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة النقل الميكانيكي.
تعمل الظهارة البولية ، وهي الظهارة الطبقية التي تغطي الجزء الداخلي من المثانة البولية ، كحاجز ، مما يمنع انتشار المواد المذابة البولية في الخلالي المثانة ، ولكنه يعمل أيضا كمحول ، ويستشعر امتلاء المثانة وينقل هذه الأحداث إلى الأعصاب والعضلات الكامنة16. أظهرت الدراسات السابقة أن الاتصال بين الظهارة البولية والأنسجة الكامنة يتطلب القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا Piezo1 و Piezo231. لتقييم عابرات Ca 2+ المستحثة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية ، تم تطوير تقنية جديدة موصوفة تستخدم نقل الجينات الفيروسية الغدية للتعبير عن مستشعر Ca2+ GCaMP5G في خلايا الظهارة البولية. تستخدم هذه التقنية إعداد ورقة مخاطية توفر وصولا سهلا إلى طبقة الخلايا المظلة الخارجية ونظام بمساعدة الكمبيوتر للتحفيز الميكانيكي المتزامن للخلايا الفردية باستخدام ماصة زجاجية مغلقة وتسجيل التغيرات في التألق بمرور الوقت.
Protocol
Representative Results
Discussion
جميع الكائنات الحية ، وعلى ما يبدو معظم أنواع الخلايا ، تعبر عن القنوات الأيونية التي تستجيب للمنبهات الميكانيكية20،33،34،35،36،37. تم تقييم وظيفة هذه القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) و S10OD028596 (إلى GA) ومن قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات الحية النموذجية لتصوير الكلى من مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
