Ex Vivo Analys av mekaniskt aktiverade Ca2+ transienter i urotelceller
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att bedöma funktionen hos mekaniskt aktiverade jonkanaler i inhemska urotelceller med hjälp av den fluorescerande Ca2+ sensorn GCaMP5G.
Abstract
Mekaniskt aktiverade jonkanaler är biologiska givare som omvandlar mekaniska stimuli såsom sträck- eller skjuvkrafter till elektriska och biokemiska signaler. Hos däggdjur är mekaniskt aktiverade kanaler väsentliga för detektering av yttre och inre stimuli i processer så olika som beröringskänsla, hörsel, volymreglering av röda blodkroppar, basal blodtrycksreglering och känslan av urinblåsans fullhet. Medan funktionen hos mekaniskt aktiverade jonkanaler har studerats utförligt i in vitro-inställningen med hjälp av patch-clamp-tekniken, är det fortfarande en svår uppgift att bedöma deras funktion i sin ursprungliga miljö, ofta på grund av begränsad tillgång till uttrycksställena för dessa kanaler (t.ex. afferenta terminaler, Merkelceller, baroreceptorer och njurtubuli) eller svårigheter att tillämpa patch-clamp-tekniken (t.ex. de apikala ytorna av uroteliala paraplyceller). Detta protokoll beskriver ett förfarande för att bedöma mekaniskt framkallade Ca 2+ transienter med hjälp av den fluorescerande sensorn GCaMP5G i ett ex vivo urotelialt preparat, en teknik som lätt kan anpassas för studier av mekaniskt framkallade Ca2+ händelser i andra naturliga vävnadspreparat.
Introduction
Epitelceller i urinvägarna utsätts för mekaniska krafter när urinfiltratet färdas genom nefronerna, och urin pumpas ut ur njurbäckenet och färdas genom urinledarna för att lagras i urinblåsan. Det har länge erkänts att mekaniska krafter (t.ex. skjuvspänning och sträckning) som utövas av vätskor på epitelcellerna som kantar urinvägarna reglerar reabsorptionen av protein i den proximala tubuli och av lösta ämnen i den distala nefronen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt lagring av urin i urinblåsan och urinering14,15,16,17.
Omvandlingen av mekaniska stimuli till elektriska och biokemiska signaler, en process som kallas mekanotransduktion, medieras av proteiner som svarar på deformationen av cellulära strukturer eller den associerade extracellulära matrisen 18,19,20,21. Mekaniskt aktiverade jonkanaler är unika i den meningen att de övergår från ett slutet tillstånd till ett öppet permeabelt tillstånd som svar på förändringar i membranspänning, tryck eller skjuvspänning 18,19,20,21,22. Dessutom kan Ca 2+ transienter initieras genom integrinmedierad mekanotransduktion eller genom aktivering av mekanoresponsiva adhesionssystem vid cell-cellkorsningar23,24,25,26. Jonkanalens funktion bedöms vanligtvis med patch-clamp-tekniken, vilket innebär bildandet av en gigaohmtätning mellan cellmembranet och patchpipetten27. Celler som ligger i djupa vävnadsskikt med en tät extracellulär matris (t.ex. njurtubuli) eller omgiven av en fysisk barriär (t.ex. glykokalyx) är emellertid svåra att komma åt med en glasmikropipett. På samma sätt kan celler inbäddade eller som är integrerade delar av vävnader med dålig mekanisk stabilitet (t.ex. urotelet) inte lätt studeras med patch-clamp-tekniken. Eftersom många mekaniskt aktiverade jonkanaler är permeabla för Ca2+, är ett alternativt tillvägagångssätt att bedöma deras aktivitet med fluorescerande mikroskopi med hjälp av ett Ca2 + -känsligt färgämne eller genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) såsom GCaMP. Nya ansträngningar inom proteinteknik har avsevärt ökat det dynamiska omfånget, känsligheten och svaret hos GECIs28,29,30, och framsteg inom genetik har möjliggjort deras uttryck i specifika cellpopulationer, vilket gör dem idealiska för att studera mekanotransduktion.
Urotelet, det stratifierade epitelet som täcker urinblåsans inre, fungerar som en barriär, förhindrar diffusion av urinlösta ämnen i urinblåsans interstitium, men fungerar också som en givare, känner av blåsans fullhet och kommunicerar dessa händelser till de underliggande nerverna och muskulaturen16. Tidigare studier har visat att kommunikationen mellan urotelet och underliggande vävnader kräver de mekaniskt aktiverade jonkanalerna Piezo1 och Piezo231. För att bedöma mekaniskt inducerade Ca 2+ transienter i urotelceller utvecklades en ny teknik som beskrivs som använder adenoviral genöverföring för att uttrycka Ca2+ sensorn GCaMP5G i urotelceller. Denna teknik använder en slemhinneberedning som ger enkel åtkomst till det yttersta paraplycellskiktet och ett datorassisterat system för samtidig mekanisk stimulering av enskilda celler med en sluten glasmikropipett och registrering av förändringar i fluorescens över tiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alla organismer, och till synes de flesta celltyper, uttrycker jonkanaler som svarar på mekaniska stimuli 20,33,34,35,36,37. Funktionen hos dessa mekaniskt aktiverade kanaler har huvudsakligen utvärderats med patch-clamp-tekniken. På grund av tillgänglighetsproblem har dock patch-clamp-studier av mekaniskt aktiverade jonk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01DK119183 (till GA och MDC) och S10OD028596 (till GA) och av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores vid Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
