Ex Vivo Анализ механически активированных переходных процессовCa 2+ в уротелиальных клетках
Summary
Этот протокол описывает методологию оценки функции механически активированных ионных каналов в нативных уротелиальных клетках с использованием флуоресцентного датчика Ca2+ GCaMP5G.
Abstract
Механически активируемые ионные каналы являются биологическими преобразователями, которые преобразуют механические стимулы, такие как силы растяжения или сдвига, в электрические и биохимические сигналы. У млекопитающих механически активированные каналы необходимы для обнаружения внешних и внутренних раздражителей в таких разнообразных процессах, как ощущение осязания, слух, регуляция объема эритроцитов, регуляция базального артериального давления и ощущение наполненности мочевого пузыря. В то время как функция механически активированных ионных каналов была широко изучена в условиях in vitro с использованием метода патч-зажима, оценка их функции в их естественной среде остается сложной задачей, часто из-за ограниченного доступа к сайтам экспрессии этих каналов (например, афферентным терминалям, клеткам Меркеля, барорецепторам и почечным канальцам) или трудностей с применением метода патч-зажима (например, апикальные поверхности уротелиальных зонтичных клеток). В этом протоколе описывается процедура оценки механически вызванных переходных процессов Ca 2+ с использованием флуоресцентного датчика GCaMP5G в уротелиальном препарате ex vivo, метод, который может быть легко адаптирован для изучения механически вызванных событий Ca2+ в других препаратах нативной ткани.
Introduction
Эпителиальные клетки в мочевыводящих путях подвергаются механическим воздействиям, когда фильтрат мочи проходит через нефроны, а моча откачивается из почечной лоханки и проходит через мочеточники для хранения в мочевом пузыре. Давно признано, что механические силы (например, напряжение сдвига и растяжение), действующие жидкостями на эпителиальные клетки, выстилающие мочевыводящие пути, регулируют реабсорбцию белка в проксимальных канальцах и растворенных веществ в дистальном отделе нефрона 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, а также накопление мочи в мочевом пузыре и мочеиспускании14,15,16,17.
Преобразование механических стимулов в электрические и биохимические сигналы, процесс, называемый механотрансдукцией, опосредуется белками, которые реагируют на деформацию клеточных структур или связанного с ними внеклеточного матрикса 18,19,20,21. Механически активированные ионные каналы уникальны в том смысле, что они переходят из замкнутого состояния в открытое проницаемое состояние в ответ на изменения натяжения мембраны, давления или напряжения сдвига 18,19,20,21,22. Кроме того, переходные процессы Ca2+ могут быть инициированы интегрин-опосредованной механотрансдукцией или активацией механочувствительных адгезионных систем на межклеточных соединениях23,24,25,26. Функцию ионного канала обычно оценивают с помощью метода пластыря-зажима, который включает образование гигаомного уплотнения между клеточной мембраной и пластырем-пипеткой27. Однако клетки, расположенные в глубоких тканевых слоях с плотным внеклеточным матриксом (например, почечные канальцы) или окруженные физическим барьером (например, гликокаликсом), труднодоступны с помощью стеклянной микропипетки. Аналогичным образом, клетки, встроенные или являющиеся неотъемлемыми частями тканей с плохой механической стабильностью (например, уротелий), не могут быть легко изучены с помощью метода пластыря. Поскольку многие механически активированные ионные каналы проницаемы для Ca 2+, альтернативным подходом является оценка их активности с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием Ca2+-чувствительного красителя или генетически кодируемых кальциевых индикаторов (GECI), таких как GCaMP. Недавние усилия в области белковой инженерии значительно увеличили динамический диапазон, чувствительность и реакцию GECI28,29,30, а достижения в области генетики позволили их экспрессию в определенных клеточных популяциях, что сделало их идеально подходящими для изучения механотрансдукции.
Уротелий, многослойный эпителий, покрывающий внутреннюю часть мочевого пузыря, функционирует как барьер, предотвращая диффузию растворенных веществ в моче в интерстиций мочевого пузыря, но также функционирует как преобразователь, определяя наполненность мочевого пузыря и сообщая об этих событиях нижележащим нервам и мускулатуре16. Предыдущие исследования показали, что для связи между уротелием и подлежащими тканями требуются механически активированные ионные каналы Piezo1 и Piezo231. Для оценки механически индуцированных переходных процессов Ca 2+ в уротелиальных клетках была разработана новая описанная методика, которая использует перенос генов аденовируса для экспрессии датчика Ca2+ GCaMP5G в уротелиальных клетках. В этом методе используется подготовка листа слизистой оболочки, которая обеспечивает легкий доступ к самому внешнему зонтичному клеточному слою, и компьютерная система для одновременной механической стимуляции отдельных клеток с помощью закрытой стеклянной микропипетки и регистрации изменений флуоресценции с течением времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все организмы и, по-видимому, большинство типов клеток экспрессируют ионные каналы, которые реагируют на механические раздражители 20,33,34,35,36,37. Функция этих механически активиров…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH R01DK119183 (для G.A. и M.D.C.) и S10OD028596 (для G.A.), а также ядрами визуализации клеток и модельных организмов почек Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
