JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מודל xenograft הנגזר מחולה לוקמיה לימפובלסטית חריפה משמש כאסטרטגיה להערכה וניטור רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי ממוקד CD19 תאי T.

Abstract

טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CART) התגלה ככלי רב עוצמה לטיפול בסוגים רבים של ממאירויות CD19+ , מה שהוביל לאישור ה- FDA לאחרונה למספר טיפולים בתאי CART ממוקדי CD19 (CART19). עם זאת, טיפול בתאי CART קשור לקבוצה ייחודית של רעילות הנושאות תחלואה ותמותה משלהן. זה כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS) ודלקת עצבית (NI). השימוש במודלים פרה-קליניים של עכברים היה חיוני במחקר ובפיתוח של טכנולוגיית CART להערכת יעילות CART ורעילות CART. המודלים הפרה-קליניים הזמינים לבדיקת אימונותרפיה תאית מאמצת זו כוללים מודלים סינגניים, קסנוגרפט, טרנסגניים ואנושיים של עכברים. אין מודל אחד שמשקף בצורה חלקה את מערכת החיסון האנושית, ולכל מודל יש חוזקות וחולשות. מאמר שיטות זה נועד לתאר מודל xenograft נגזר המטופל באמצעות פיצוצים לוקמיים מחולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה כאסטרטגיה להערכת רעילות הקשורה CART19, CRS ו- NI. מודל זה הוכח כמחזיר רעילות הקשורה ל- CART19, כמו גם יעילות טיפולית כפי שניתן לראות במרפאה.

Introduction

טיפול תאי בקולטן אנטיגן כימרי T (CART) חולל מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן. הוא הוכח כמוצלח בטיפול בלוקמיה לימפובלסטית חריפה חוזרת / עקשנית (ALL), לימפומה של תאי B גדולים, לימפומה של תאי מעטפת, לימפומה פוליקולרית ומיאלומה נפוצה 1,2,3,4,5,6,7, מה שהוביל לאישורי FDA אחרונים. למרות ההצלחה הראשונית בניסויים קליניים, הטיפול בתאי CART גורם לרעילות שהיא לעתים קרובות חמורה ולעיתים קטלנית. הרעלים הנפוצים ביותר לאחר טיפול בתאי CART כוללים התפתחות של CRS ו- NI, המכונה גם תסמונת נוירוטוקסיות הקשורה לתאי השפעה חיסוניים (ICANS)8,9. CRS נגרמת עקב פעילות יתר והתרחבות מסיבית של תאי CART in vivo, מה שמוביל להפרשה לאחר מכן של ציטוקינים דלקתיים מרובים, כולל אינטרפרון-γ, גורם נמק גידול-α, גרנולוציטים-מקרופאגים גורם מגרה מושבה (GM-CSF), ואינטרלוקין-6 (IL-6). התוצאה היא לחץ דם נמוך, חום גבוה, תסמונת דליפת נימים, כשל נשימתי, כשל רב איברי, ובמקרים מסוימים, מוות10,11. CRS מתפתח ב 50-100% מהמקרים לאחר טיפול תאי CART1911,12,13. ICANS הוא אירוע שלילי ייחודי נוסף הקשור לטיפול בתאי CART ומאופיין בצקת מוחית כללית, בלבול, אובטונדציה, אפזיה, חולשה מוטורית, ולעיתים התקפים 9,14. כל דרגה של ICANS מתרחשת בעד 70% מהחולים, וכיתות 3-4 מדווחות ב 20-30% מהחולים 5,10,15,16. באופן כללי, CRS ו-ICANS נפוצים ועלולים להיות קטלניים.

ניהול ICANS לאחר טיפול בתאי CART הוא מאתגר. רוב החולים עם ICANS חווים גם CRS17, אשר לעתים קרובות ניתן לטפל עם אנטגוניסט קולטן IL-6 tocilizumab או סטרואידים18. דו”ח קודם גילה כי התערבות מוקדמת עם tocilizumab הפחיתה את שיעור CRS חמור אך לא השפיעה על ההיארעות או החומרה של ICANS19. נכון לעכשיו, אין טיפול יעיל או סוכן מניעתי עבור ICANS, וזה חיוני לחקור אסטרטגיות מניעה20.

תאים מיאלואידים וציטוקינים/כימוקינים הקשורים אליהם נחשבים למניעים העיקריים להתפתחות CRS ו-ICANS21. בעוד CRS קשור ישירות לגובה קיצוני של ציטוקינים והתפשטות תאי T, הפתופיזיולוגיה של ICANS אינה ידועה במידה רבה22,23. לכן, זה הכרחי להקים מודל עכבר כי reapitulates אלה רעילות לאחר טיפול בתאי CART כדי ללמוד את המנגנונים ולפתח אסטרטגיות מניעה.

ישנם מודלים פרה-קליניים רבים של בעלי חיים המשמשים כיום למחקר, אופטימיזציה ואימות היעילות של תאי CART, כמו גם לניטור הרעילות הקשורה אליהם. אלה כוללים עכברים סינגניים, קסנוגרפט, טרנסגניים בעלי יכולת חיסון, עכברים טרנסגניים אנושיים ועכברי קסנוגרפט שמקורם במטופל, בנוסף למודלים של פרימטים. עם זאת, לכל אחד מהמודלים הללו יש חסרונות, וחלקם אינם משקפים את היעילות האמיתית או חששות הבטיחות של תאי CART24,25. לכן, חובה לבחור בקפידה את המודל הטוב ביותר למטרות המיועדות של המחקר.

מאמר זה מבקש לתאר את המתודולוגיה המשמשת להערכת רעילות הקשורה לתאי CART, CRS ו-NI, באמצעות מודל של קסנוגרפט (PDX) in vivo (PDX) שמקורו במטופל (איור 1). באופן ספציפי, בשיטות המתוארות כאן, תאי CART19 שנוצרו במעבדה של המחברים משמשים בעקבות פרוטוקולים שתוארו לעיל. בקצרה, תאי T אנושיים מבודדים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים בריאים של תורמים (PBMCs) באמצעות טכניקת שיפוע צפיפות, מגורים עם חרוזי CD3 / CD28 ביום 0, ומומרים באופן לנטיוויראלי ביום הראשון עם CARs המורכבים ממקטע משתנה שרשרת יחיד ממוקד CD19 המאוחה לתחומי איתות 4-1BB ו- CD3ζ. תאי CART אלה מורחבים לאחר מכן, מנוטרלים מחרוזים ביום 6, ונשמרים בהקפאה ביום 8 26,27,28,29,30. כפי שתואר קודם לכן, עכברים נתונים לטיפול בלימפודל, ואחריו מתן פיצוצים לוקמיים שמקורם במטופל (ALL)28. ראשית, השתלת הגידול מאומתת באמצעות איסוף דם submandibular. לאחר קביעת נטל גידול מתאים, תאי CART19 ניתנים לעכברים. לאחר מכן, העכברים נשקלים מדי יום כדי להעריך את רווחתם. הדמיית תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים (MRI) מבוצעת כדי להעריך NI, יחד עם דימום זנב כדי להעריך את התרחבות תאי T וייצור ציטוקינים/כימוקינים. מומלץ מאוד להשתמש בטכניקות המתוארות להלן כמודל לחקר רעילות הקשורה לתאי CART במודל PDX.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של מועצת הביקורת המוסדית של מאיו קליניק (IRB), הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC A00001767) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC, Bios00000006.04). הערה: כל החומרים המשמשים לעבודה עם עכברים חייבים להיות סטריליים. 1. הזרקת busulfan לעכברי…

Representative Results

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך רעילות הקשורה לתאי CART באמצעות מודל עכברי PDX מתאי גידול של חולים עם ALL (איור 1). ראשית, עכברי NSG קיבלו זריקות i.p. של busulfan (30 מ”ג / ק”ג) במטרה לדכא אותם חיסונית ולהקל על קליטת תאי CART28. למחרת, הם קיבלו ~ 5 × 106 PBMCs (i.v.) שמקורם בכל החולים. העכבר?…

Discussion

בדו”ח זה תוארה מתודולוגיה להערכת רעילות הקשורה לתאי CART באמצעות מודל ALL PDX. באופן ספציפי יותר, מודל זה מבקש לחקות שתי רעילויות מסכנות חיים, CRS ו- NI, שחולים חווים לעתים קרובות לאחר עירוי של תאי CART. הוא משחזר סימני היכר רבים של רעילות CART שנצפו במרפאה: ירידה במשקל, תפקוד מוטורי לקוי, דלקת עצבית, ייצ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה חלקית באמצעות המכונים הלאומיים לבריאות (R37CA266344, 1K99CA273304), משרד ההגנה (CA201127), צינור K2R של מאיו קליניק (S.S.K.), מרכז מאיו קליניק לרפואה אינדיבידואלית (S.S.K.), וקרן פרדולין (R.L.S). בנוסף, ברצוננו להודות לצוות מתקן הליבה NMR של מאיו קליניק. איור 1 נוצר בשנת BioRender.com

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin’s lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Recherche en cancérologie. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

Keywords: CAR-TAcute Lymphoblastic LeukemiaPatient-derived XenograftToxicity AssessmentMotor WeaknessWeight LossCytokine AnalysisMRI ImagingBreathing MonitoringParaVision Software
check_url/fr/64535?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image