JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Recherche en cancérologie

Vurdering af kimær antigenreceptor T-celleassocieret toksicitet ved hjælp af en patientafledt xenograft musemodel med akut lymfoblastær leukæmi

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

Her beskriver vi en protokol, hvor en akut lymfoblastisk leukæmipatientafledt xenograftmodel anvendes som en strategi til at vurdere og overvåge CD19-målrettede kimære antigenreceptor T-celleassocierede toksiciteter.

Abstract

Chimeric antigen receptor T (CART) celleterapi har vist sig som et kraftfuldt værktøj til behandling af flere typer CD19+ maligniteter, hvilket har ført til den nylige FDA-godkendelse af flere CD19-målrettede CART (CART19) celleterapier. Imidlertid er CART-celleterapi forbundet med et unikt sæt toksiciteter, der bærer deres egen sygelighed og dødelighed. Dette omfatter cytokinfrigivelsessyndrom (CRS) og neuroinflammation (NI). Brugen af prækliniske musemodeller har været afgørende for forskning og udvikling af CART-teknologi til vurdering af både CART-effekt og CART-toksicitet. De tilgængelige prækliniske modeller til test af denne adoptive cellulære immunterapi omfatter syngeneic, xenograft, transgene og humaniserede musemodeller. Der er ingen enkelt model, der problemfrit afspejler det menneskelige immunsystem, og hver model har styrker og svagheder. Dette metodepapir har til formål at beskrive en patientafledt xenograftmodel ved hjælp af leukæmiske blaster fra patienter med akut lymfoblastær leukæmi som en strategi til vurdering af CART19-associerede toksiciteter, CRS og NI. Denne model har vist sig at rekapitulere CART19-associerede toksiciteter såvel som terapeutisk effekt som set i klinikken.

Introduction

Chimeric antigen receptor T (CART) celleterapi har revolutioneret området for cancer immunterapi. Det har vist sig at være vellykket til behandling af recidiverende/ildfast akut lymfoblastær leukæmi (ALL), stort B-celle lymfom, mantelcellelymfom, follikulært lymfom og myelomatose 1,2,3,4,5,6,7, hvilket fører til nylige FDA-godkendelser. På trods af den indledende succes i kliniske forsøg resulterer behandling med CART-celleterapi i toksiciteter, der ofte er alvorlige og lejlighedsvis dødelige. De mest almindelige toksiciteter efter CART-celleterapi omfatter udvikling af CRS og NI, også kaldet immuneffektorcelleassocieret neurotoksicitetssyndrom (ICANS)8,9. CRS er forårsaget på grund af overaktivering og massiv ekspansion af CART-celler in vivo, hvilket fører til den efterfølgende sekretion af flere inflammatoriske cytokiner, herunder interferon-γ, tumornekrosefaktor-α, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-6 (IL-6). Dette resulterer i hypotension, høj feber, kapillær lækagesyndrom, respirationssvigt, multiorgansvigt og i nogle tilfælde død10,11. CRS udvikler sig i 50-100% af tilfældene efter CART19 celleterapi11,12,13. ICANS er en anden unik bivirkning forbundet med CART-celleterapi og er karakteriseret ved generaliseret cerebralt ødem, forvirring, obtundation, afasi, motorisk svaghed og lejlighedsvis anfald 9,14. Enhver grad af ICANS forekommer hos op til 70% af patienterne, og grad 3-4 rapporteres hos 20-30% af patienterne 5,10,15,16. Samlet set er CRS og ICANS almindelige og kan være dødelige.

Håndteringen af ICANS efter CART-celleterapi er udfordrende. De fleste patienter med ICANS oplever også CRS17, som ofte kan behandles med IL-6-receptorantagonisten tocilizumab eller steroider18. En tidligere rapport viste, at tidlig intervention med tocilizumab reducerede hyppigheden af svær CRS, men ikke påvirkede forekomsten eller sværhedsgraden af ICANS19. I øjeblikket er der ingen effektiv behandling eller profylaktisk middel til ICANS, og det er afgørende at undersøge forebyggende strategier20.

Myeloide celler og tilhørende cytokiner/kemokiner menes at være de vigtigste drivkræfter bag udviklingen af CRS og ICANS21. Mens CRS er direkte relateret til den ekstreme forhøjelse af cytokiner og T-celleekspansion, er patofysiologien af ICANS stort set ukendt22,23. Derfor er det bydende nødvendigt at etablere en musemodel, der rekapitulerer disse toksiciteter efter CART-celleterapi for at studere mekanismerne og udvikle forebyggende strategier.

Der er flere prækliniske dyremodeller, der i øjeblikket bruges til at studere, optimere og validere effektiviteten af CART-celler samt til at overvåge deres tilknyttede toksiciteter. Disse omfatter syngeneiske, xenograft, immunkompetente transgene, humaniserede transgene og patientafledte xenograftmus ud over primatmodeller. Imidlertid har hver af disse modeller ulemper, og nogle afspejler ikke den sande effektivitet eller sikkerhedsproblemer ved CART-celler24,25. Derfor er det bydende nødvendigt omhyggeligt at vælge den bedste model for de tilsigtede mål for undersøgelsen.

Denne artikel søger at beskrive den metode, der bruges til at vurdere CART-celleassocierede toksiciteter, CRS og NI, ved hjælp af en ALL-patientafledt xenograft (PDX) in vivo-model (figur 1). Specifikt anvendes CART19-celler genereret i forfatterens laboratorium i de her beskrevne metoder efter tidligere beskrevne protokoller. Kort fortalt isoleres humane T-celler fra raske mononukleære celler i donorperifert blod (PBMC’er) via en densitetsgradientteknik, stimuleret med CD3 / CD28-perler på dag 0 og lentiviralt transduceret på dag 1 med CAR’er sammensat af et CD19-målrettet enkeltkædevariabelfragment smeltet sammen til 4-1BB og CD3ζ signaldomæner. Disse CART-celler udvides derefter, de-beades på dag 6 og kryopræserveres på dag 8 26,27,28,29,30. Som tidligere beskrevet udsættes mus for lymfodepleterende behandling efterfulgt af administration af patientafledte leukæmiske blaster (ALL)28. For det første verificeres tumorindkapsling via submandibulær blodindsamling. Efter etablering af en passende tumorbyrde administreres CART19-celler til musene. Derefter vejes musene dagligt for at vurdere trivsel. Små dyrs magnetiske resonansbilleddannelse (MRI) udføres for at vurdere NI, sammen med haleblødning for at vurdere T-celleudvidelse og cytokin / kemokinproduktion. De teknikker, der er beskrevet nedenfor, anbefales stærkt at blive brugt som model til at studere CART-celleassocierede toksiciteter i en PDX-model.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne fra Mayo Clinic’s Institutional Review Board (IRB), Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) og Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04). BEMÆRK: Alle materialer, der bruges til at arbejde med mus, skal være sterile. 1. Injektion af busulfan til NSG-mus Få hanmus, 8-12 uger gamle, immunkompromitterede, NOD-SCID IL2rγnull (NSG), og vej dem før injektion.BE…

Representative Results

Formålet med denne protokol er at vurdere CART-celleassocierede toksiciteter ved hjælp af en PDX-musemodel fra tumorceller hos patienter med ALL (figur 1). Først modtog NSG-mus i.p. injektioner af busulfan (30 mg / kg) med det formål at immunsupprimere dem og lette CART-celleindkapsling28. Den følgende dag modtog de ~ 5 × 106 PBMC’er (i.v.) afledt af ALLE patienter. Musene blev overvåget for engraftment i ~ 13 uger via haleblødningsanalysen…

Discussion

I denne rapport er der beskrevet en metode til vurdering af CART-celleassocierede toksiciteter ved hjælp af en ALL PDX-model. Mere specifikt søger denne model at efterligne to livstruende toksiciteter, CRS og NI, som patienter ofte oplever efter infusion af CART-celler. Det rekapitulerer mange kendetegn ved CART-toksiciteter observeret i klinikken: vægttab, motorisk dysfunktion, neuroinflammation, inflammatorisk cytokin- og kemokinproduktion og infiltration af forskellige effektorceller i centralnervesystemet 8,20,28….

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev delvist støttet gennem National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) og Predolin Foundation (R.L.S.). Derudover vil vi gerne takke Mayo Clinic NMR Core Facility personale. Figur 1 blev oprettet i BioRender.com

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin’s lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Recherche en cancérologie. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

CAR-TAcute Lymphoblastic LeukemiaPatient-derived XenograftToxicity AssessmentMotor WeaknessWeight LossCytokine AnalysisMRI ImagingBreathing MonitoringParaVision Software

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image