Her beskriver vi en protokol, hvor en akut lymfoblastisk leukæmipatientafledt xenograftmodel anvendes som en strategi til at vurdere og overvåge CD19-målrettede kimære antigenreceptor T-celleassocierede toksiciteter.
Chimeric antigen receptor T (CART) celleterapi har vist sig som et kraftfuldt værktøj til behandling af flere typer CD19+ maligniteter, hvilket har ført til den nylige FDA-godkendelse af flere CD19-målrettede CART (CART19) celleterapier. Imidlertid er CART-celleterapi forbundet med et unikt sæt toksiciteter, der bærer deres egen sygelighed og dødelighed. Dette omfatter cytokinfrigivelsessyndrom (CRS) og neuroinflammation (NI). Brugen af prækliniske musemodeller har været afgørende for forskning og udvikling af CART-teknologi til vurdering af både CART-effekt og CART-toksicitet. De tilgængelige prækliniske modeller til test af denne adoptive cellulære immunterapi omfatter syngeneic, xenograft, transgene og humaniserede musemodeller. Der er ingen enkelt model, der problemfrit afspejler det menneskelige immunsystem, og hver model har styrker og svagheder. Dette metodepapir har til formål at beskrive en patientafledt xenograftmodel ved hjælp af leukæmiske blaster fra patienter med akut lymfoblastær leukæmi som en strategi til vurdering af CART19-associerede toksiciteter, CRS og NI. Denne model har vist sig at rekapitulere CART19-associerede toksiciteter såvel som terapeutisk effekt som set i klinikken.
Chimeric antigen receptor T (CART) celleterapi har revolutioneret området for cancer immunterapi. Det har vist sig at være vellykket til behandling af recidiverende/ildfast akut lymfoblastær leukæmi (ALL), stort B-celle lymfom, mantelcellelymfom, follikulært lymfom og myelomatose 1,2,3,4,5,6,7, hvilket fører til nylige FDA-godkendelser. På trods af den indledende succes i kliniske forsøg resulterer behandling med CART-celleterapi i toksiciteter, der ofte er alvorlige og lejlighedsvis dødelige. De mest almindelige toksiciteter efter CART-celleterapi omfatter udvikling af CRS og NI, også kaldet immuneffektorcelleassocieret neurotoksicitetssyndrom (ICANS)8,9. CRS er forårsaget på grund af overaktivering og massiv ekspansion af CART-celler in vivo, hvilket fører til den efterfølgende sekretion af flere inflammatoriske cytokiner, herunder interferon-γ, tumornekrosefaktor-α, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-6 (IL-6). Dette resulterer i hypotension, høj feber, kapillær lækagesyndrom, respirationssvigt, multiorgansvigt og i nogle tilfælde død10,11. CRS udvikler sig i 50-100% af tilfældene efter CART19 celleterapi11,12,13. ICANS er en anden unik bivirkning forbundet med CART-celleterapi og er karakteriseret ved generaliseret cerebralt ødem, forvirring, obtundation, afasi, motorisk svaghed og lejlighedsvis anfald 9,14. Enhver grad af ICANS forekommer hos op til 70% af patienterne, og grad 3-4 rapporteres hos 20-30% af patienterne 5,10,15,16. Samlet set er CRS og ICANS almindelige og kan være dødelige.
Håndteringen af ICANS efter CART-celleterapi er udfordrende. De fleste patienter med ICANS oplever også CRS17, som ofte kan behandles med IL-6-receptorantagonisten tocilizumab eller steroider18. En tidligere rapport viste, at tidlig intervention med tocilizumab reducerede hyppigheden af svær CRS, men ikke påvirkede forekomsten eller sværhedsgraden af ICANS19. I øjeblikket er der ingen effektiv behandling eller profylaktisk middel til ICANS, og det er afgørende at undersøge forebyggende strategier20.
Myeloide celler og tilhørende cytokiner/kemokiner menes at være de vigtigste drivkræfter bag udviklingen af CRS og ICANS21. Mens CRS er direkte relateret til den ekstreme forhøjelse af cytokiner og T-celleekspansion, er patofysiologien af ICANS stort set ukendt22,23. Derfor er det bydende nødvendigt at etablere en musemodel, der rekapitulerer disse toksiciteter efter CART-celleterapi for at studere mekanismerne og udvikle forebyggende strategier.
Der er flere prækliniske dyremodeller, der i øjeblikket bruges til at studere, optimere og validere effektiviteten af CART-celler samt til at overvåge deres tilknyttede toksiciteter. Disse omfatter syngeneiske, xenograft, immunkompetente transgene, humaniserede transgene og patientafledte xenograftmus ud over primatmodeller. Imidlertid har hver af disse modeller ulemper, og nogle afspejler ikke den sande effektivitet eller sikkerhedsproblemer ved CART-celler24,25. Derfor er det bydende nødvendigt omhyggeligt at vælge den bedste model for de tilsigtede mål for undersøgelsen.
Denne artikel søger at beskrive den metode, der bruges til at vurdere CART-celleassocierede toksiciteter, CRS og NI, ved hjælp af en ALL-patientafledt xenograft (PDX) in vivo-model (figur 1). Specifikt anvendes CART19-celler genereret i forfatterens laboratorium i de her beskrevne metoder efter tidligere beskrevne protokoller. Kort fortalt isoleres humane T-celler fra raske mononukleære celler i donorperifert blod (PBMC’er) via en densitetsgradientteknik, stimuleret med CD3 / CD28-perler på dag 0 og lentiviralt transduceret på dag 1 med CAR’er sammensat af et CD19-målrettet enkeltkædevariabelfragment smeltet sammen til 4-1BB og CD3ζ signaldomæner. Disse CART-celler udvides derefter, de-beades på dag 6 og kryopræserveres på dag 8 26,27,28,29,30. Som tidligere beskrevet udsættes mus for lymfodepleterende behandling efterfulgt af administration af patientafledte leukæmiske blaster (ALL)28. For det første verificeres tumorindkapsling via submandibulær blodindsamling. Efter etablering af en passende tumorbyrde administreres CART19-celler til musene. Derefter vejes musene dagligt for at vurdere trivsel. Små dyrs magnetiske resonansbilleddannelse (MRI) udføres for at vurdere NI, sammen med haleblødning for at vurdere T-celleudvidelse og cytokin / kemokinproduktion. De teknikker, der er beskrevet nedenfor, anbefales stærkt at blive brugt som model til at studere CART-celleassocierede toksiciteter i en PDX-model.
I denne rapport er der beskrevet en metode til vurdering af CART-celleassocierede toksiciteter ved hjælp af en ALL PDX-model. Mere specifikt søger denne model at efterligne to livstruende toksiciteter, CRS og NI, som patienter ofte oplever efter infusion af CART-celler. Det rekapitulerer mange kendetegn ved CART-toksiciteter observeret i klinikken: vægttab, motorisk dysfunktion, neuroinflammation, inflammatorisk cytokin- og kemokinproduktion og infiltration af forskellige effektorceller i centralnervesystemet 8,20,28….
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet gennem National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) og Predolin Foundation (R.L.S.). Derudover vil vi gerne takke Mayo Clinic NMR Core Facility personale. Figur 1 blev oprettet i BioRender.com
APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |