Vurdering af de formodede antikryptokokegenskaber af rå og klarede ekstrakter fra bløddyr
Summary
Det humane svampepatogen Cryptococcus neoformans producerer en række virulensfaktorer (fx peptidaser) for at fremme dets overlevelse i værten. Miljønicher repræsenterer en lovende kilde til nye naturlige peptidasehæmmere. Denne protokol beskriver fremstillingen af ekstrakter fra bløddyr og vurderingen af deres virkning på produktionen af svampevirulensfaktor.
Abstract
Cryptococcus neoformans er et indkapslet humant svampepatogen med en global fordeling, der primært inficerer immunkompromitterede individer. Den udbredte anvendelse af svampemidler i kliniske omgivelser, deres anvendelse i landbruget og stammehybridisering har ført til øget udvikling af resistens. Denne stigende resistens over for svampemidler er en voksende bekymring blandt klinikere og forskere over hele verden, og der er øget presserende behov for at udvikle nye svampedræbende behandlinger. For eksempel producerer C. neoformans flere virulensfaktorer, herunder intra- og ekstracellulære enzymer (fx peptidaser) med roller i vævsnedbrydning, cellulær regulering og næringsstofoptagelse. Forstyrrelsen af en sådan peptidaseaktivitet af inhibitorer forstyrrer svampevækst og spredning, hvilket tyder på, at dette kan være en vigtig strategi til bekæmpelse af patogenet. Det er vigtigt, at hvirvelløse dyr som bløddyr producerer peptidasehæmmere med biomedicinske anvendelser og antimikrobiel aktivitet, men de er underudforsket med hensyn til deres anvendelse mod svampepatogener. I denne protokol blev en global ekstraktion fra bløddyr udført for at isolere potentielle peptidasehæmmere i rå og klarede ekstrakter, og deres virkninger mod klassiske kryptokokvirulensfaktorer blev vurderet. Denne metode understøtter prioriteringen af bløddyr med svampedræbende egenskaber og giver mulighed for opdagelse af antivirulensmidler ved at udnytte de naturlige hæmmere, der findes i bløddyr.
Introduction
Cryptococcus neoformans er et humant svampepatogen, der producerer alvorlig sygdom hos immunkompromitterede værter, såsom personer, der lever med hiv / aids1, og fører til ca. 19% af aids-relaterede dødsfald2. Svampen er modtagelig for flere klasser af svampemidler, herunder azoler, polyener og flucytosin, som udøver fungicid og fungistatisk aktivitet ved anvendelse af forskellige mekanismer 3,4. Imidlertid har den omfattende anvendelse af svampemidler i kliniske og landbrugsmæssige omgivelser kombineret med stammehybridisering forstærket udviklingen af resistens i flere svampearter, herunder C. neoformans5.
For at overvinde udfordringerne ved svamperesistens og reducere forekomsten af svampeinfektioner på globalt plan er en lovende tilgang at bruge virulensfaktorerne for Cryptococcus spp. (f.eks. temperaturtilpasningsevne, polysaccharidkapsel, melanin og ekstracellulære enzymer) som potentielle terapeutiske mål 4,6 . Denne tilgang har flere fordele, da disse virulensfaktorer er velkarakteriserede i litteraturen, og målretning af disse faktorer kan potentielt reducere hastigheden af svampedræbende resistens ved at pålægge et svagere selektivt tryk ved at forringe virulens snarere end at målrette cellevækst6. I denne sammenhæng har adskillige undersøgelser vurderet muligheden for at målrette ekstracellulære enzymer (f.eks. proteaser, peptidaser) for at reducere eller hæmme virulensen af Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismer som hvirvelløse dyr og planter har ikke et adaptivt immunsystem til at beskytte sig mod patogener. De er imidlertid afhængige af et stærkt medfødt immunsystem med et enormt udvalg af kemiske forbindelser til at håndtere mikroorganismer og rovdyr10. Disse molekyler indbefatter peptidasehæmmere, som spiller vigtige roller i mange biologiske systemer, herunder de cellulære processer af hvirvelløse immuniteter, såsom koagulation af hæmolymfe, syntese af cytokiner og antimikrobielle peptider og beskyttelse af værter ved direkte inaktivering af proteaser af patogener11. Således har peptidasehæmmere fra hvirvelløse dyr som bløddyr potentielle biomedicinske anvendelser, men mange forbliver ukarakteriserede10,12,13. I denne sammenhæng er der ca. 34 arter af terrestriske bløddyr i Ontario og 180 ferskvandsbløddyr i Canada14. Deres dybdegående profilering og karakterisering er dog stadig begrænset15. Disse organismer udgør en mulighed for identifikation af nye forbindelser med potentiel svampedræbende aktivitet10.
I denne protokol beskrives metoder til isolering og klaring af ekstrakter fra hvirvelløse dyr (f.eks. bløddyr) (figur 1) efterfulgt af måling af den formodede peptidasehæmmende aktivitet. De antifungale egenskaber af disse ekstrakter vurderes derefter ved at måle deres indvirkning på C. neoformans virulensfaktorproduktion ved hjælp af fænotypiske assays (figur 2). Det er vigtigt at bemærke, at forskelle i svampedræbende egenskaber mellem rå og klarede ekstrakter kan være tegn på mikrobielle faktorer (f.eks. sekundære metabolitter eller toksiner produceret af værtsmikrobiomet) hos bløddyret, som kan påvirke eksperimentelle observationer. Sådanne resultater understøtter behovet for, at denne protokol vurderer både rå og afklarede ekstrakter uafhængigt for at optrævle virkningsmekanismerne. Derudover er ekstraktionsprocessen upartisk og kan muliggøre påvisning af antimikrobielle egenskaber mod en overflod af svampe- og bakteriepatogener. Derfor giver denne protokol et initieringspunkt for prioritering af bløddyrarter med svampedræbende egenskaber mod C. neoformans og en mulighed for at evaluere forbindelserne mellem enzymatisk aktivitet og virulensfaktorproduktion gennem formodede hæmmende mekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ekstraktionsprotokollen beskrevet her skitserer isoleringen af forbindelser fra bløddyr indsamlet fra Ontario, Canada, og demonstrerer en ny undersøgelse af anvendelse af bløddyrekstrakter mod det humane svampepatogen, C. neoformans. Denne protokol føjer sig til en voksende mængde forskning, der undersøger peptidasehæmmeraktivitet fra hvirvelløse dyr13. Under ekstraktionen var nogle ekstraktprøver vanskelige at filtrere-sterilisere, muligvis på grund af tilstedeværelsen af opl?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker medlemmer af Geddes-McAlister Lab for deres værdifulde støtte gennem hele denne undersøgelse og deres manuskriptfeedback. Forfatterne anerkender finansieringsstøtten fra Ontario Graduate Scholarship og International Graduate Research Award – University of Guelph til D. G.-G og fra Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) og Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award for J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
