軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価
Summary
ヒト真菌病原体クリプ トコッカス・ネオフォルマンスは 、宿主内での生存を促進するために様々な病原性因子(例えば、ペプチダーゼ)を産生する。環境ニッチは、新規天然ペプチダーゼ阻害剤の有望な供給源です。このプロトコルは、軟体動物からの抽出物の調製と真菌病原性因子産生に対するそれらの効果の評価を概説しています。
Abstract
クリプトコッカスネオフォルマンスは 、主に免疫不全の個人に感染する世界的な分布を持つカプセル化されたヒト真菌病原体です。臨床現場での抗真菌剤の広範な使用、農業での使用、および株のハイブリダイゼーションにより、耐性の進化が進んでいます。抗真菌剤に対する耐性のこの上昇率は、世界中の臨床医や科学者の間で懸念が高まっており、新しい抗真菌療法を開発する緊急性が高まっています。例えば、 C. neoformans は、組織分解、細胞調節、および栄養素獲得に関与する細胞内および細胞外の酵素(ペプチダーゼなど)を含むいくつかの病原性因子を産生します。阻害剤によるこのようなペプチダーゼ活性の破壊は、真菌の増殖と増殖を阻害し、これが病原体と戦うための重要な戦略である可能性があることを示唆しています。重要なことに、軟体動物などの無脊椎動物は、生物医学的用途と抗菌活性を備えたペプチダーゼ阻害剤を産生しますが、真菌病原体に対する使用法に関しては未調査です。このプロトコルでは、軟体動物からの全体的な抽出を実施して、粗抽出物および清澄抽出物中の潜在的なペプチダーゼ阻害剤を分離し、古典的なクリプトコッカス病原性因子に対するそれらの効果を評価しました。この方法は、抗真菌特性を持つ軟体動物の優先順位付けをサポートし、軟体動物に見られる天然の阻害剤を利用することにより、抗病原性剤の発見の機会を提供します。
Introduction
クリプトコッカス・ネオフォルマンスは、HIV/AIDS陽性者などの免疫不全宿主に重篤な疾患を引き起こすヒト真菌病原体であり1、エイズ関連の死亡の約19%につながります2。真菌は、アゾール、ポリエン、フルシトシンを含むいくつかのクラスの抗真菌剤の影響を受けやすく、これらは異なるメカニズムを使用して殺菌および静真菌活性を発揮します3,4。しかし、臨床および農業現場での抗真菌剤の広範な使用と株のハイブリダイゼーションの組み合わせにより、C. neoformans5を含む複数の真菌種における耐性の進化が増幅されました。
抗真菌耐性の課題を克服し、世界規模で真菌感染症の有病率を減らすために、有望なアプローチは、クリプトコッカス属の病原性因子(温度適応性、多糖カプセル、メラニン、細胞外酵素など)を潜在的な治療標的として使用することです4,6。.これらの病原性因子は文献で十分に特徴付けられており、これらの因子を標的とすることで、細胞増殖を標的とするのではなく、病原性を損なうことによってより弱い選択圧を課すことによって抗真菌耐性の速度を低下させる可能性があるため、このアプローチにはいくつかの利点があります6。これに関連して、多くの研究が、クリプトコッカス属の病原性を低下または阻害するために細胞外酵素(例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ)を標的とする可能性を評価している7,8,9。
無脊椎動物や植物のような生物は、病原体から身を守るための適応免疫システムを持っていません。しかし、彼らは微生物や捕食者に対処するために、膨大な数の化合物を含む強力な自然免疫システムに依存しています10。これらの分子には、血リンパの凝固、サイトカインや抗菌ペプチドの合成、病原体のプロテアーゼを直接不活性化することによる宿主の保護など、無脊椎動物免疫の細胞プロセスなど、多くの生物学的システムで重要な役割を果たすペプチダーゼ阻害剤が含まれます11。したがって、軟体動物などの無脊椎動物由来のペプチダーゼ阻害剤は、潜在的な生物医学的用途を有するが、多くは特徴付けられていないままである10,12,13。これに関連して、オンタリオ州には約34種の陸生軟体動物がおり、カナダには180種の淡水軟体動物がいます14。ただし、それらの詳細なプロファイリングと特性評価はまだ限られています15。これらの生物は、潜在的な抗真菌活性を有する新規化合物の同定の機会を提供する10。
このプロトコールでは、無脊椎動物(例えば、軟体動物)からの抽出物を単離および清澄化し(図1)、続いて推定ペプチダーゼ阻害活性を測定する方法が記載されている。次に、これらの抽出物の抗真菌特性は、表現型アッセイを使用して C.ネオフォルマンスの 病原性因子産生への影響を測定することによって評価されます(図2)。粗抽出物と清澄抽出物の抗真菌特性の違いは、軟体動物の微生物因子(例えば、宿主微生物叢によって産生される二次代謝産物または毒素)を示している可能性があり、実験観察に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。.このような知見は、このプロトコルが粗抽出物と清澄抽出物の両方を独立して評価して作用機序を解明する必要性を裏付けています。さらに、抽出プロセスは偏りがなく、多数の真菌および細菌性病原体に対する抗菌特性の検出を可能にする可能性があります。したがって、このプロトコルは、 C.ネオフォルマンス に対する抗真菌特性を持つ軟体動物種の優先順位付けの開始点を提供し、推定阻害メカニズムを通じて酵素活性と病原性因子産生との関係を評価する機会を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する抽出プロトコルは、カナダのオンタリオ州から収集された軟体動物からの化合物の分離の概要を説明し、ヒト真菌病原体である C.neoformansに対して軟体動物抽出物を使用する新しい調査を示しています。このプロトコルは、無脊椎動物からのペプチダーゼ阻害剤活性を調査する研究の増加に追加されます13。抽出中、一部の抽出物サンプルは、おそらく?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この調査と原稿のフィードバックを通じて貴重なサポートを提供してくれたGeddes-McAlisterLabのメンバーに感謝します。著者らは、オンタリオ大学院奨学金および国際大学院研究賞-グエルフ大学からD.G.-Gへの資金提供、およびカナダイノベーション財団(JELF 38798)およびオンタリオ州大学省-J.G.-Mの早期研究者賞からの資金提供の支援を認めています。
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
