Hyperthermie générée par ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique: une méthode de traitement réalisable dans un modèle de rhabdomyosarcome murin
Summary
Un protocole d’utilisation de l’hyperthermie contrôlée, générée par des ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique, pour déclencher la libération de médicaments à partir de liposomes sensibles à la température dans un modèle murin de rhabdomyosarcome.
Abstract
Les ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique (MRgHIFU) sont une méthode établie pour produire une hyperthermie localisée. Compte tenu de l’imagerie en temps réel et de la modulation acoustique de l’énergie, cette modalité permet un contrôle précis de la température dans une zone définie. De nombreuses applications thermiques sont explorées avec cette technologie non invasive et non ionisante, telle que la génération d’hyperthermie, pour libérer des médicaments à partir de transporteurs liposomaux thermosensibles. Ces médicaments peuvent inclure des chimiothérapies telles que la doxorubicine, pour lesquelles une libération ciblée est souhaitée en raison des effets secondaires systémiques limitant la dose, à savoir la cardiotoxicité. La doxorubicine est un pilier pour le traitement d’une variété de tumeurs malignes et est couramment utilisée dans le rhabdomyosarcome (RMS) récidivant ou récurrent. RMS est la tumeur extracrânienne des tissus mous solides la plus courante chez les enfants et les jeunes adultes. Malgré une thérapie multimodale agressive, les taux de survie au RMS sont restés les mêmes au cours des 30 dernières années. Pour explorer une solution pour répondre à ce besoin non satisfait, un protocole expérimental a été développé pour évaluer la libération de doxorubicine liposomale thermosensible (TLD) dans un modèle murin RMS syngénique immunocompétent en utilisant MRgHIFU comme source d’hyperthermie pour la libération de médicaments.
Introduction
Le rhabdomyosarcome (RMS) est une tumeur musculaire squelettique qui survient le plus souvent chez les enfants et les jeunes adultes1. La maladie localisée est souvent traitée par un traitement multimodal, y compris la chimiothérapie, les rayonnements ionisants et la chirurgie. L’utilisation de schémas de chimiothérapie multimédicaments est plus fréquente chez les patients pédiatriques, avec de meilleurs résultats par rapport à leurs homologues adultes2; Cependant, malgré les efforts de recherche en cours, le taux de survie à 5 ans reste autour de 30% dans la forme la plus agressive de la maladie 3,4. La norme de soins de chimiothérapie est un régime multimédicamenteux qui comprend la vincristine, le cyclophosphamide et l’actinomycine D. En cas de récidive ou de récidive, d’autres chimiothérapies sont utilisées, notamment la doxorubicine standard (libre) et l’ifosfamide1. Alors que toutes ces chimiothérapies ont des toxicités systémiques, la cardiotoxicité de la doxorubicine impose une limitation de dose à vie 5-7. Pour augmenter la quantité de médicament délivrée à la tumeur et minimiser la toxicité systémique, des formulations alternatives ont été développées, y compris l’encapsulation liposomale. Il peut s’agir de doxorubicine non thermosensible, qui a été approuvée pour le traitement du cancer du sein et du carcinome hépatocellulaire, ou de doxorubicine thermosensible, pour laquelle des essais cliniques sont en cours 8,9,10,11,12,13. Des méthodes alternatives pour administrer des médicaments encapsulés liposomaux tels que les liposomes multi-vésiculaires et les liposomes ciblés par ligand ont été évaluées et sont prometteuses pour le traitement des tumeurs9. Dans cette étude, l’ajout de chaleur a des impacts multifactoriels, y compris la libération de médicaments14. La combinaison de l’hyperthermie (HT) générée par des ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique (MRgHIFU) et de la doxorubicine liposomale thermosensible (TLD) est une nouvelle approche thérapeutique multimodale pour utiliser ce médicament toxique mais efficace pour traiter les RMS, tout en minimisant la toxicité limitant la dose et en augmentant potentiellement la réponse immunitaire à la tumeur.
La doxorubicine libère rapidement de TLD à des températures de >39 °C, bien supérieures à la température moyenne du corps humain de 37 °C, mais pas assez élevées pour causer des lésions tissulaires ou une ablation; cela commence à se produire à 43 °C, mais se produit plus rapidement lorsque les températures approchent 60 °C15. Diverses méthodes ont été utilisées pour générer l’HT in vivo, y compris les lasers, les micro-ondes, l’ablation par radiofréquence et les ultrasons focalisés, dont beaucoup sont des méthodes de chauffage invasives16. MRgHIFU est une méthode de chauffage non invasive et non ionisante qui facilite les réglages précis de la température dans le tissu cible in situ. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) fournit une imagerie en temps réel, où un logiciel informatique peut être utilisé, pour calculer une mesure thermométrique du tissu tout au long du traitement; Par la suite, ces données peuvent être utilisées pour contrôler la thérapie par ultrasons en temps réel afin d’atteindre et de maintenir un point de consigne de température souhaité17. MRgHIFU a été testé dans différents types de tissus et peut être utilisé pour une large gamme de traitements thermiques, de l’HT légère à l’ablation, ainsi que cliniquement pour traiter avec succès les métastases osseuses douloureuses18. De plus, il a été démontré que l’HT provoque une cytotoxicité tumorale, module l’expression des protéines et modifie la réponse immunitaire dans le microenvironnement tumoral 19,20,21,22. Une étude a combiné une HT légère avec TLD, suivie d’une ablation avec MRgHIFU, dans un modèle de rat R1 synergique23, entraînant une nécrose dans le noyau tumoral et l’administration de médicaments à la périphérie. Traditionnellement, la radiothérapie a été utilisée comme traitement d’appoint pour endommager les cellules tumorales et diminuer la récurrence locale de la maladie. Cependant, son utilisation est limitée par le dosage à vie et les dommages hors cible1. Ainsi, l’HT est unique en ce sens qu’elle peut causer certains des mêmes effets sans les mêmes toxicités ou limitations.
Les modèles animaux précliniques pour RMS comprennent des modèles immunocompétents syngéniques et des xénogreffes dérivées de patients (PDX) chez des hôtes immunodéprimés. Bien que les modèles immunodéprimés permettent la croissance des tumeurs humaines, ils manquent du microenvironnement tumoral approprié et sont limités dans leur capacité à étudier la réponse immunitaire24. La mutation activant le FGFR4 est un marqueur prometteur d’un mauvais pronostic et une cible thérapeutique potentielle chez les RMS 1,25 chez l’adulte et l’enfant. Dans les modèles RMS syngéniques développés dans le laboratoire de Gladdy, les tumeurs sont capables de se développer chez un hôte immunocompétent, qui développe des réponses immunitaires innées et adaptatives à la tumeur26. Comme l’HT influence la réponse immunitaire, l’observation du changement de la réponse immunitaire murine est un avantage précieux de ce modèle tumoral. Pour tester à la fois la réponse tumorale à la TLD par rapport à la DF, ainsi que le changement de la réponse immunitaire de la tumeur à la chimiothérapie et à l’HT, un protocole a été développé et utilisé pour traiter les tumeurs RMS murines syngéniques in vivo en utilisant MRgHIFU et TLD, qui est l’objet de cette étude.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole développé ici a été utilisé pour cibler les tumeurs des membres postérieurs en utilisant MRgHIFU pour un traitement HT léger et libérer des médicaments encapsulés à partir de liposomes in vivo. Plusieurs étapes critiques ont été rencontrées dans ce protocole au cours de l’étude pilote, et l’optimisation de ces étapes critiques explique l’amélioration du succès du traitement par rapport à l’étude pilote. Le premier est l’élimination complète des poils sur la zone à s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier nos sources de financement pour ce projet et le personnel impliqué, y compris : la subvention de recherche C17, la bourse d’études supérieures du Canada, le Fonds en fiducie pour les possibilités d’études de l’Ontario et le Fonds James J. Hammond.
Materials
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| 1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
| 2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
| 7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
| C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
| Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
| Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
| Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
| DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
| DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
| DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
| Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
| Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
| F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
| FBS | Wisent | 081-105 | |
| Froggarose | FroggaBio | A87 | |
| Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
| Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
| Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
| Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
| MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
| Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
| p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
| PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
| Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
| Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
| Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
| Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
| SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| TAE | Wisent | 811-540-FL | |
| Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
| Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |
References
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