자기 공명 유도 고강도 집속 초음파 생성 온열요법: 쥐 횡문근육종 모델에서 실현 가능한 치료 방법
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 횡문근육종 마우스 모델에서 온도에 민감한 리포솜에서 약물 방출을 유발하기 위해 자기 공명 유도 고강도 집속 초음파에 의해 생성된 제어된 온열요법을 사용하는 프로토콜입니다.
Abstract
자기 공명 유도 고강도 집속 초음파(MRgHIFU)는 국소 온열요법을 생성하기 위해 확립된 방법입니다. 실시간 이미징 및 음향 에너지 변조를 감안할 때 이 방식을 통해 정의된 영역 내에서 정밀한 온도 제어가 가능합니다. 온열요법 생성과 같은 이 비침습적, 비이온화 기술을 사용하여 온도에 민감한 리포솜 운반체에서 약물을 방출하는 많은 열 응용 분야가 연구되고 있습니다. 이러한 약물에는 독소루비신과 같은 화학 요법이 포함될 수 있으며, 용량 제한 전신 부작용, 즉 심장 독성으로 인해 표적 방출이 필요합니다. 독소루비신은 다양한 악성 종양 치료의 주류이며 재발성 또는 재발성 횡문근육종(RMS)에 일반적으로 사용됩니다. RMS는 소아 및 젊은 성인에서 가장 흔한 고형 연조직 두개외 종양입니다. 공격적인 복합 요법에도 불구하고 RMS 생존율은 지난 30년 동안 동일하게 유지되었습니다. 이러한 미충족 수요를 해결하기 위한 솔루션을 탐색하기 위해 약물 방출을 위한 온열요법의 공급원으로 MRgHIFU를 사용하여 면역적격 동계 RMS 마우스 모델에서 온도민감성 리포솜 독소루비신(TLD)의 방출을 평가하기 위한 실험 프로토콜이 개발되었습니다.
Introduction
횡문근육종(RMS)은 소아와 젊은 성인에게 가장 흔하게 발생하는 골격근 종양이다1. 국소 질환은 종종 화학 요법, 전리 방사선 및 수술을 포함한 복합 치료로 치료됩니다. 다제 화학요법의 사용은 소아 환자에서 더 많이 사용되며, 성인 환자에 비해 예후가 개선되었다2. 그러나 지속적인 연구 노력에도 불구하고 5 년 생존율은 가장 공격적인 형태의 질병에서 약 30 %에 머물러 있습니다 3,4. 화학 요법 표준 치료는 빈크리스틴, 시클로포스파미드 및 악티노마이신 D를 포함하는 다제 요법입니다. 재발성 또는 재발성 질환의 경우 표준(유리) 독소루비신(FD) 및 이포스파미드1을 포함한 대체 화학 요법이 사용됩니다. 이 모든 화학 요법은 전신 독성을 가지고 있지만, 독소루비신의 심장 독성은 평생 용량 제한 5-7을 부과합니다. 종양에 전달되는 약물의 양을 증가시키고 전신 독성을 최소화하기 위해, 리포솜 캡슐화를 포함하는 대체 제형이 개발되었다. 이들은 유방암 및 간세포 암종의 치료를 위해 승인된 비온민감성 독소루비신 또는 임상 시험이 진행 중인 온도감응성 독소루비신일 수 있다 8,9,10,11,12,13. 다발성 소포 리포솜 및 리간드 표적 리포솜과 같은 리포솜 캡슐화 약물을 전달하기 위한 대체 방법이 평가되었으며 종양 치료에 대한 가능성을 보여줍니다9. 이 연구에서, 열의 추가는 약물 방출을 포함한 다인성 영향을 미친다14. 자기공명유도 고강도 집속 초음파(MRgHIFU)와 온도민감성 리포솜 독소루비신(TLD)으로 생성된 온열요법(HT)의 조합은 용량 제한 독성을 최소화하고 종양에 대한 면역 반응을 잠재적으로 증가시키면서 RMS를 치료하기 위해 이 독성이 있지만 효과적인 약물을 사용하기 위한 새로운 복합 치료 접근법입니다.
독소루비신은 >39 °C의 온도에서 TLD에서 빠르게 방출되며, 이는 평균 인체 온도 37 °C보다 훨씬 높지만 조직 손상이나 절제를 유발할 만큼 높지는 않습니다. 이것은 43 °C에서 발생하기 시작하지만, 온도가 60 °C에 가까워질수록 더 빠르게 발생한다15. 생체 내에서 HT를 생성하기 위해 레이저, 마이크로파, 고주파 절제, 집속 초음파 등 다양한 방법이 사용되어 왔으며, 그 중 다수는 침습적 가열 방법이다16. MRgHIFU는 현장 표적 조직 내에서 정확한 온도 설정을 용이하게 하는 비침습적이고 비이온화 가열 방법입니다. 자기 공명(MR) 영상은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 치료 전반에 걸쳐 조직의 체온 측정을 계산할 수 있는 실시간 영상을 결정적으로 제공합니다. 이어서, 이 데이터는 원하는 온도 설정점(17)에 도달하고 유지하기 위해 실시간으로 초음파 요법을 제어하는데 사용될 수 있다. MRgHIFU는 다양한 조직 유형에서 테스트되었으며, 경미한 HT에서 절제에 이르기까지 광범위한 체온 치료에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 임상적으로 고통스러운 뼈 전이를 성공적으로 치료할 수 있다18. 또한, HT는 종양 미세환경 19,20,21,22에서 종양 세포독성을 유발하고, 단백질 발현을 조절하며, 면역 반응을 변화시키는 것으로 나타났다. 한 연구에서는 시너지 효과가 있는 R1 쥐 모델23에서 경미한 HT와 TLD를 결합한 후 MRgHIFU로 절제하여 종양 코어에 괴사를 일으키고 말초에 약물을 전달했습니다. 전통적으로 방사선 요법은 종양 세포를 손상시키고 국소 질병 재발을 줄이기 위한 보조 요법으로 사용되었습니다. 그러나 평생 투여 및 표적 이탈 손상으로 인해 사용이 제한됩니다1. 따라서 HT는 동일한 독성이나 제한 없이 동일한 효과 중 일부를 일으킬 수 있다는 점에서 독특합니다.
RMS에 대한 전임상 동물 모델에는 면역저하 숙주에서 동유전자 면역적격 모델 및 환자 유래 이종이식(PDX)이 포함됩니다. 면역저하 모델은 인간 종양의 성장을 허용하지만, 적절한 종양 미세환경이 부족하고 면역 반응을 연구하는 능력에 한계가 있다24. FGFR4 활성화 돌연변이는 불량한 예후에 대한 유망한 마커이며 성인 및 소아 RMS 1,25에서 잠재적인 치료 표적입니다. 글래디(Gladdy) 연구실에서 개발된 동유전자 RMS 모델에서, 종양은 종양에 대한 선천성 및 적응성 면역 반응을 발달시키는 면역적격 숙주에서 성장할 수 있다26. HT가 면역 반응에 영향을 미치기 때문에 쥐 면역 반응의 변화를 관찰하는 것이 이 종양 모델의 중요한 이점입니다. FD와 비교하여 TLD에 대한 종양 반응과 화학 요법 및 HT 모두에 대한 종양의 면역 반응의 변화를 모두 테스트하기 위해 MRgHIFU 및 TLD를 사용하여 생체 내에서 동계 쥐 RMS 종양을 치료하기 위한 프로토콜이 개발되고 채택되었으며, 이는 이 연구의 초점입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에서 개발된 프로토콜은 경미한 HT 치료를 위해 MRgHIFU를 사용하여 뒷다리 종양을 표적으로 삼고 생체 내에서 리포솜으로부터 캡슐화된 약물을 방출하는 데 사용되었습니다. 파일럿 연구 동안 이 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 발생했으며 이러한 중요한 단계를 최적화하면 파일럿 연구에 비해 치료 성공률이 향상되었습니다. 첫 번째는 초음파 처리 할 부위의 머리카락을 완전히 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트에 대한 자금 출처와 C17 연구 보조금, 캐나다 대학원 장학금, 온타리오 학생 기회 신탁 기금 및 James J. Hammond 기금을 포함한 관련 인력에게 감사드립니다.
Materials
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| 1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
| 2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
| 7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
| C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
| Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
| Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
| Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
| DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
| DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
| DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
| Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
| Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
| F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
| FBS | Wisent | 081-105 | |
| Froggarose | FroggaBio | A87 | |
| Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
| Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
| Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
| Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
| MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
| Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
| p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
| PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
| Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
| Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
| Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
| Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
| SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| TAE | Wisent | 811-540-FL | |
| Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
| Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |
References
- Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
- Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
- . Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019)
- Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
- Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
- Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
- Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
- Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12 (2017).
- Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
- . A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019)
- PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021)
- . Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO) Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018)
- De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107 (2021).
- Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
- Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
- Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
- Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
- Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65 (2016).
- Dewhirst, M. W., Lee, C. -. T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
- Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
- Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
- Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
- Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
- De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564 (2021).
- McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
- Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
- Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
- Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816 (2021).
- Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973 (2022).
