Præsenteret her er en protokol til brug af kontrolleret hypertermi, genereret af magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralyd, til at udløse lægemiddelfrigivelse fra temperaturfølsomme liposomer i en rhabdomyosarcoma musemodel.
Magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralyd (MRgHIFU) er en etableret metode til fremstilling af lokaliseret hypertermi. I betragtning af billeddannelse i realtid og akustisk energimodulering muliggør denne modalitet præcis temperaturkontrol inden for et defineret område. Mange termiske applikationer udforskes med denne ikke-invasive, ikke-ioniserende teknologi, såsom hypertermigenerering, for at frigive lægemidler fra termofølsomme liposomale bærere. Disse lægemidler kan omfatte kemoterapier såsom doxorubicin, for hvilke målrettet frigivelse ønskes på grund af de dosisbegrænsende systemiske bivirkninger, nemlig kardiotoksicitet. Doxorubicin er en grundpille til behandling af en række maligne tumorer og er almindeligt anvendt i recidiverende eller tilbagevendende rhabdomyosarcoma (RMS). RMS er den mest almindelige ekstrakranielle tumor i fast blødt væv hos børn og unge voksne. På trods af aggressiv, multimodal terapi har RMS-overlevelsesraten været den samme i de sidste 30 år. For at undersøge en løsning til at imødekomme dette uopfyldte behov blev der udviklet en eksperimentel protokol til evaluering af frigivelsen af termosensitiv liposomal doxorubicin (TLD) i en immunokompetent, syngeneisk RMS-musemodel ved hjælp af MRgHIFU som kilde til hypertermi til lægemiddelfrigivelse.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en skeletmuskeltumor, der oftest forekommer hos børn og unge voksne1. Lokaliseret sygdom behandles ofte med multimodal behandling, herunder kemoterapi, ioniserende stråling og kirurgi. Brugen af kemoterapiregimer med flere lægemidler er mere udbredt hos pædiatriske patienter med forbedrede resultater sammenlignet med deres voksne kolleger2; På trods af igangværende forskningsindsats forbliver den 5-årige overlevelsesrate imidlertid på omkring 30% i den mest aggressive form af sygdommen 3,4. Kemoterapistandarden for pleje er et multidrug regime, der omfatter vincristin, cyclophosphamid og actinomycin D. I tilfælde af recidiverende eller tilbagevendende sygdom anvendes alternative kemoterapier, herunder standard (fri) doxorubicin (FD) og ifosfamid1. Mens alle disse kemoterapier har systemiske toksiciteter, pålægger doxorubicins kardiotoksicitet en livslang dosisbegrænsning 5-7. For at øge mængden af lægemidlet, der leveres til tumoren og for at minimere systemisk toksicitet, er der udviklet alternative formuleringer, herunder liposomal indkapsling. Disse kan være ikke-termosensitivt doxorubicin, som er godkendt til behandling af brystkræft og hepatocellulært karcinom, eller termosensitivt doxorubicin, for hvilket kliniske forsøg er i gang 8,9,10,11,12,13. Alternative metoder til levering af liposomale indkapslede lægemidler såsom multivesikulære liposomer og ligandmålrettede liposomer er blevet evalueret og viser løfte om behandling af tumorer9. I denne undersøgelse har tilsætningen af varme multifaktorielle virkninger, herunder lægemiddelfrigivelse14. Kombinationen af hypertermi (HT) genereret med magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralyd (MRgHIFU) og termosensitiv liposomal doxorubicin (TLD) er en ny multimodal terapeutisk tilgang til anvendelse af dette giftige, men effektive lægemiddel til behandling af RMS, samtidig med at dosisbegrænsende toksicitet minimeres og potentielt øger immunresponset på tumoren.
Doxorubicin frigives hurtigt fra TLD ved temperaturer >39 °C, et godt stykke over den gennemsnitlige menneskelige kropstemperatur på 37 °C, men ikke høj nok til at forårsage vævsskade eller ablation; dette begynder at ske ved 43 ° C, men sker hurtigere, når temperaturen nærmer sig 60 ° C15. Forskellige metoder er blevet brugt til at generere HT in vivo, herunder lasere, mikrobølger, radiofrekvensablation og fokuseret ultralyd, hvoraf mange er invasive opvarmningsmetoder16. MRgHIFU er en ikke-invasiv, ikke-ioniserende opvarmningsmetode, der letter præcise temperaturindstillinger inden for målvævet in situ. Magnetisk resonans (MR) billeddannelse giver afgørende billeddannelse i realtid, hvor computersoftware kan bruges, til at beregne en termometrimåling af vævet under hele behandlingen; Derefter kan disse data bruges til at kontrollere ultralydsbehandlingen i realtid for at nå og opretholde et ønsket temperaturindstillingspunkt17. MRgHIFU er blevet testet i forskellige vævstyper og kan bruges til en bred vifte af temperaturbehandlinger, fra mild HT til ablation, såvel som klinisk til vellykket behandling af smertefulde knoglemetastaser18. Derudover har HT vist sig at forårsage tumorcytotoksicitet, modulere proteinekspression og ændre immunresponset i tumormikromiljøet 19,20,21,22. En undersøgelse kombinerede mild HT med TLD efterfulgt af ablation med MRgHIFU i en synergetisk R1-rottemodel23, hvilket resulterede i nekrose i tumorkernen og lægemiddelafgivelse til periferien. Traditionelt er strålebehandling blevet brugt som en supplerende terapi til at beskadige tumorceller og mindske lokal sygdomsgentagelse. Imidlertid er dets anvendelse begrænset af levetidsdosering og skader uden for målet1. HT er således unik, fordi det kan forårsage nogle af de samme virkninger uden de samme toksiciteter eller begrænsninger.
Prækliniske dyremodeller for RMS omfatter syngeneiske immunkompetente modeller og patientafledte xenotransplantater (PDX) hos immunkompromitterede værter. Mens de immunkompromitterede modeller tillader vækst af de humane tumorer, mangler de det passende tumormikromiljø og er begrænsede i deres evne til at studere immunrespons24. FGFR4-aktiverende mutation er en lovende markør for dårlig prognose og et potentielt terapeutisk mål i voksen og pædiatrisk RMS 1,25. I de syngeneiske RMS-modeller, der er udviklet i Gladdy-laboratoriet, er tumorerne i stand til at vokse i en immunkompetent vært, som udvikler medfødte og adaptive immunresponser på tumoren26. Da HT påvirker immunresponset, er observation af ændringen i murinimmunresponset en værdifuld fordel ved denne tumormodel. For at teste både tumorresponset på TLD sammenlignet med FD såvel som ændringen i tumorens immunrespons til både kemoterapi og HT blev der udviklet en protokol, der blev anvendt til behandling af syngeneiske murine RMS-tumorer in vivo ved hjælp af MRgHIFU og TLD, som er fokus for denne undersøgelse.
Protokollen udviklet heri blev brugt til at målrette bagekstremitetstumorer ved hjælp af MRgHIFU til mild HT-behandling og frigive indkapslede lægemidler fra liposomer in vivo. Flere kritiske trin blev fundet i denne protokol under pilotundersøgelsen, og optimering af disse kritiske trin tegnede sig for den forbedrede behandlingssucces i forhold til pilotstudiet. For det første er fuldstændig fjernelse af håret på det område, der skal sonikeres. Enhver gasfangst i pelsen forhindrer ultralydstrålen i at…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende vores finansieringskilder til dette projekt og det involverede personale, herunder: C17 Research Grant, Canada Graduate Scholarship, Ontario Student Opportunity Trust Fund og James J. Hammond Fund.
1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
FBS | Wisent | 081-105 | |
Froggarose | FroggaBio | A87 | |
Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
Isoflurane | Sigma | 792632 | |
M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
TAE | Wisent | 811-540-FL | |
Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |