이미징 유세포 분석 및 인공 지능을 사용한 소핵 분석의 자동화
Summary
소핵(MN) 분석은 DNA 손상을 정량화하기 위한 잘 확립된 검사입니다. 그러나 수동 현미경 또는 특징 기반 이미지 분석과 같은 기존 기술을 사용하여 분석에 점수를 매기는 것은 힘들고 어렵습니다. 이 논문은 이미징 유세포 분석 데이터를 사용하여 MN 분석의 점수를 매기는 인공 지능 모델을 개발하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
소핵(MN) 분석은 유전 독성에 대한 화학 물질을 평가하기 위해 전 세계적으로 규제 기관에서 사용됩니다. 분석은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 한 번 분할된 사이토카인시스 차단 이핵세포 또는 완전히 분할된 단핵구 세포에서 MN을 채점합니다. 역사적으로 광학 현미경은 분석에 점수를 매기는 황금 표준 방법이었지만 힘들고 주관적입니다. 유세포 분석은 최근 몇 년 동안 분석의 점수를 매기기 위해 사용되었지만 세포 이미지의 주요 측면을 시각적으로 확인할 수 없기 때문에 제한적입니다. 이미징 유세포 분석(IFC)은 고처리량 이미지 캡처와 자동화된 이미지 분석을 결합하며, MN 분석에서 모든 주요 이벤트의 이미지를 빠르게 획득하고 점수를 매기는 데 성공적으로 적용되었습니다. 최근에는 컨볼루션 신경망을 기반으로 하는 인공 지능(AI) 방법을 사용하여 IFC에서 획득한 MN 분석 데이터의 점수를 매길 수 있음이 입증되었습니다. 이 백서에서는 AI 소프트웨어를 사용하여 딥 러닝 모델을 만들어 모든 주요 이벤트에 점수를 매기고 이 모델을 적용하여 추가 데이터에 자동으로 점수를 매기는 모든 단계를 설명합니다. AI 딥 러닝 모델의 결과는 수동 현미경과 잘 비교되므로 IFC와 AI를 결합하여 MN 분석의 완전 자동 스코어링이 가능합니다.
Introduction
소핵(micronucleus, MN) 분석은 인체용 화장품, 의약품 및 화학물질 개발에서 DNA 손상을 평가하기 위한 유전독성학의 기본이다 1,2,3,4. 소핵은 분열 후 핵에 통합되지 않고 핵과 분리된 작은 원형체로 응축되는 전체 염색체 또는 염색체 조각으로 형성됩니다. 따라서, MN은 유전독성 시험1에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 종말점으로 사용될 수 있다.
MN을 정량화하는 데 선호되는 방법은 Cyt-B(Cyt-B)를 사용하여 분열을 차단하여 일회성 분열 이핵 세포(BNC) 내에서 하는 것입니다. 이 버전의 분석에서 세포 독성은 단핵구(MONO) 및 다핵구(POLY) 세포의 점수를 매겨 평가됩니다. 이 분석은 또한 증식을 평가하기 위해 노출 전 및 노출 후 세포 수를 사용하여 세포 독성을 평가하여 더 빠르고 쉽게 점수를 매길 수 있는 차단되지 않은 MONO 세포에서 MN을 채점하여 수행할 수 있습니다 5,6.
분석의 물리적 채점은 역사적으로 수동 현미경을 통해 수행되어 왔으며, 이를 통해 모든 주요 이벤트를 시각적으로 확인할 수 있습니다. 그러나 수동 현미경 검사는 어렵고 주관적입니다1. 따라서 현미경 슬라이드 스캐닝 및 유세포 분석을 포함한 자동화 기술이 개발되었으며 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 슬라이드 스캐닝 방법을 사용하면 주요 이벤트를 시각화할 수 있지만 슬라이드는 최적의 세포 밀도로 생성되어야 하므로 달성하기 어려울 수 있습니다. 또한, 이 기술은 종종 세포질 시각화가 부족하여 MONO 및 POLY 세포의 스코어링을 손상시킬 수 있습니다 7,8. 유세포 분석은 고처리량 데이터 캡처를 제공하지만 세포를 용해해야 하므로 Cyt-B 형태의 분석을 사용할 수 없습니다. 추가적으로, 비이미징 기술로서, 종래의 유세포 분석은 주요 이벤트(9,10)의 시각적 검증을 제공하지 않는다.
따라서, MN 분석을 수행하기 위해 이미징 유세포 분석법(IFC)이 조사되었다. ImageStreamX Mk II는 기존 유세포 분석의 속도 및 통계적 견고성과 현미경의 고분해능 이미징 기능을 단일 시스템11에 결합합니다. IFC를 사용함으로써, 모든 주요 이벤트들의 고해상도 이미지가 캡처될 수 있고, 특징-기반(12,13) 또는 인공지능(AI) 기술들(14,15)을 사용하여 자동으로 스코어링될 수 있다는 것이 보여졌다. IFC를 사용하여 MN 분석을 수행함으로써 더 짧은 시간 내에 현미경에 비해 더 많은 세포의 자동 스코어링을 달성할 수 있습니다.
이 작업은 이전에 설명된 이미지 분석 워크플로우(16 )에서 벗어나 Amnis AI 소프트웨어(이하 “AI 소프트웨어”로 지칭됨)를 사용하여 랜덤 포레스트(RF) 및/또는 컨볼루션 신경망(CNN) 모델을 개발하고 훈련하는 데 필요한 모든 단계를 논의합니다. AI 지원 태깅 도구를 사용하여 실측 데이터를 채우고, 모델 학습 결과를 해석하고, 추가 데이터를 분류하기 위한 모델 적용, 유전독성 및 세포독성계산 허용 등 필요한 모든 단계를 설명합니다 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 작업은 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 MN 분석의 스코어링을 자동화하는 방법을 설명합니다. 몇몇 최근의 간행물들은 직관적이고, 상호작용적인 도구들이 심층적인 계산 지식(18,19)에 대한 필요 없이 이미지 데이터를 분석하기 위한 딥 러닝 모델들의 생성들을 허용한다는 것을 보여주었다. 사용자 인터페이스 기반 소프트웨어 패키지를 사…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
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