Automatización del ensayo de micronúcleos mediante citometría de flujo de imágenes e inteligencia artificial
Summary
El ensayo de micronúcleos (MN) es una prueba bien establecida para cuantificar el daño del ADN. Sin embargo, calificar el ensayo utilizando técnicas convencionales como la microscopía manual o el análisis de imágenes basado en características es laborioso y desafiante. Este artículo describe la metodología para desarrollar un modelo de inteligencia artificial para calificar el ensayo MN utilizando datos de citometría de flujo de imágenes.
Abstract
El ensayo de micronúcleos (MN) es utilizado en todo el mundo por los organismos reguladores para evaluar los productos químicos en busca de toxicidad genética. El ensayo se puede realizar de dos maneras: marcando MN en células binucleadas bloqueadas por citocinesis una vez divididas o células mononucleadas completamente divididas. Históricamente, la microscopía óptica ha sido el método estándar de oro para calificar el ensayo, pero es laborioso y subjetivo. La citometría de flujo se ha utilizado en los últimos años para calificar el ensayo, pero está limitada por la incapacidad de confirmar visualmente aspectos clave de las imágenes celulares. La citometría de flujo de imágenes (IFC) combina la captura de imágenes de alto rendimiento y el análisis automatizado de imágenes, y se ha aplicado con éxito para adquirir rápidamente imágenes y calificar todos los eventos clave en el ensayo MN. Recientemente, se ha demostrado que los métodos de inteligencia artificial (IA) basados en redes neuronales convolucionales se pueden utilizar para calificar los datos de ensayos MN adquiridos por IFC. En este documento se describen todos los pasos para usar el software de IA para crear un modelo de aprendizaje profundo para calificar todos los eventos clave y aplicar este modelo para calificar automáticamente datos adicionales. Los resultados del modelo de aprendizaje profundo de IA se comparan bien con la microscopía manual, lo que permite una puntuación totalmente automatizada del ensayo MN mediante la combinación de IFC e IA.
Introduction
El ensayo de micronúcleos (MN) es fundamental en toxicología genética para evaluar el daño del ADN en el desarrollo de cosméticos, productos farmacéuticos y productos químicos para uso humano 1,2,3,4. Los micronúcleos se forman a partir de cromosomas enteros o fragmentos de cromosomas que no se incorporan al núcleo después de la división y se condensan en cuerpos pequeños y circulares separados del núcleo. Por lo tanto, MN puede ser utilizado como un punto final para cuantificar el daño del ADN en las pruebas de genotoxicidad1.
El método preferido para cuantificar MN es dentro de células binucleadas una vez divididas (BNC) mediante el bloqueo de la división utilizando citochalasina-B (Cyt-B). En esta versión del ensayo, la citotoxicidad también se evalúa mediante la puntuación de células mononucleadas (MONO) y polinucleadas (POLY). El ensayo también se puede realizar marcando MN en células MONO desbloqueadas, que es más rápido y fácil de puntuar, y la citotoxicidad se evalúa utilizando recuentos celulares previos y posteriores a la exposición para evaluar la proliferación 5,6.
La puntuación física del ensayo se ha realizado históricamente a través de microscopía manual, ya que esto permite la confirmación visual de todos los eventos clave. Sin embargo, la microscopía manual es desafiante y subjetiva1. Por lo tanto, se han desarrollado técnicas automatizadas, incluido el escaneo de portaobjetos de microscopio y la citometría de flujo, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones. Mientras que los métodos de escaneo de diapositivas permiten visualizar eventos clave, las diapositivas deben crearse con una densidad celular óptima, lo que puede ser difícil de lograr. Además, esta técnica a menudo carece de visualización citoplasmática, lo que puede comprometer la puntuación de las células MONO y POLY 7,8. Si bien la citometría de flujo ofrece una captura de datos de alto rendimiento, las células deben ser lisadas, lo que no permite el uso de la forma Cyt-B del ensayo. Además, como técnica no imagenológica, la citometría de flujo convencional no proporciona validación visual de eventos clave 9,10.
Por lo tanto, se ha investigado la citometría de flujo por imágenes (IFC) para realizar el ensayo MN. La ImageStreamX Mk II combina la velocidad y la robustez estadística de la citometría de flujo convencional con las capacidades de imagen de alta resolución de la microscopía en un solo sistema11. Se ha demostrado que mediante el uso de IFC, las imágenes de alta resolución de todos los eventos clave se pueden capturar y calificar automáticamente utilizando técnicas basadas en características 12,13 o inteligencia artificial (IA) 14,15. Mediante el uso de IFC para realizar el ensayo MN, se puede lograr la puntuación automática de muchas más células en comparación con la microscopía en un período de tiempo más corto.
Este trabajo se desvía de un flujo de trabajo de análisis de imágenes descrito anteriormente16 y discute todos los pasos necesarios para desarrollar y entrenar un modelo de bosque aleatorio (RF) y / o red neuronal convolucional (CNN) utilizando el software Amnis AI (en adelante, “software de IA”). Se describen todos los pasos necesarios, incluido el llenado de datos reales sobre el terreno utilizando herramientas de etiquetado asistidas por IA, la interpretación de los resultados del entrenamiento del modelo y la aplicación del modelo para clasificar datos adicionales, lo que permite el cálculo de la genotoxicidad y la citotoxicidad15.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trabajo presentado aquí describe el uso de algoritmos de aprendizaje profundo para automatizar la puntuación del ensayo MN. Varias publicaciones recientes han demostrado que las herramientas intuitivas e interactivas permiten la creación de modelos de aprendizaje profundo para analizar datos de imágenes sin necesidad de un conocimiento computacional profundo18,19. El protocolo descrito en este trabajo utilizando un paquete de software basado en interfaz de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
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