Automatisering av mikrokärnanalysen med hjälp av avbildningsflödescytometri och artificiell intelligens
Summary
Mikrokärnanalysen (MN) är ett väletablerat test för kvantifiering av DNA-skador. Att göra analysen med konventionella tekniker som manuell mikroskopi eller funktionsbaserad bildanalys är dock mödosamt och utmanande. Detta dokument beskriver metoden för att utveckla en artificiell intelligensmodell för att poängsätta MN-analysen med hjälp av bildflödescytometridata.
Abstract
Mikrokärnanalysen (MN) används över hela världen av tillsynsorgan för att utvärdera kemikalier för genetisk toxicitet. Analysen kan utföras på två sätt: genom att poängsätta MN i en gång uppdelade, cytokineseblockerade binukleerade celler eller helt uppdelade mononukleerade celler. Historiskt sett har ljusmikroskopi varit guldstandardmetoden för att göra analysen, men det är mödosamt och subjektivt. Flödescytometri har använts under de senaste åren för att poängsätta analysen, men begränsas av oförmågan att visuellt bekräfta viktiga aspekter av cellulära bilder. Imaging flow cytometry (IFC) kombinerar bildtagning med hög genomströmning och automatiserad bildanalys och har framgångsrikt tillämpats för att snabbt få bilder av och poängsätta alla viktiga händelser i MN-analysen. Nyligen har det visats att metoder för artificiell intelligens (AI) baserade på konvolutionella neurala nätverk kan användas för att poängsätta MN-analysdata som förvärvats av IFC. I det här dokumentet beskrivs alla steg för att använda AI-programvara för att skapa en djupinlärningsmodell för att poängsätta alla viktiga händelser och tillämpa den här modellen för att automatiskt poängsätta ytterligare data. Resultat från AI-djupinlärningsmodellen jämförs väl med manuell mikroskopi, vilket möjliggör helt automatiserad poängsättning av MN-analysen genom att kombinera IFC och AI.
Introduction
Mikrokärnanalysen (MN) är grundläggande inom genetisk toxikologi för att utvärdera DNA-skador vid utveckling av kosmetika, läkemedel och kemikalier för humant bruk 1,2,3,4. Mikrokärnor bildas av hela kromosomer eller kromosomfragment som inte införlivas i kärnan efter delning och kondenseras till små, cirkulära kroppar separerade från kärnan. Således kan MN användas som slutpunkt för att kvantifiera DNA-skador vid genotoxicitetstestning1.
Den föredragna metoden för kvantifiering av MN är inom en gång uppdelade binucleated cells (BNC) genom att blockera delning med cytochalasin-B (Cyt-B). I denna version av analysen bedöms cytotoxicitet också genom att poängsätta mononukleerade (MONO) och polynukleerade (POLY) celler. Analysen kan också utföras genom att poängsätta MN i oblockerade MONO-celler, vilket är snabbare och lättare att poängsätta, med cytotoxicitet som bedöms med hjälp av celltal före och efter exponering för att bedöma proliferation 5,6.
Fysisk poängsättning av analysen har historiskt utförts genom manuell mikroskopi, eftersom detta möjliggör visuell bekräftelse av alla viktiga händelser. Manuell mikroskopi är dock utmanande och subjektiv1. Således har automatiserade tekniker utvecklats, inklusive mikroskopskanning och flödescytometri, var och en med sina egna fördelar och begränsningar. Medan diaskanningsmetoder gör det möjligt att visualisera viktiga händelser, måste bilder skapas med optimal celldensitet, vilket kan vara svårt att uppnå. Dessutom saknar denna teknik ofta cytoplasmatisk visualisering, vilket kan äventyra poängsättningen av MONO och POLY celler 7,8. Medan flödescytometri erbjuder datainsamling med hög genomströmning måste cellerna lyseras, vilket inte tillåter användning av Cyt-B-formen av analysen. Dessutom, som en icke-avbildningsteknik, ger konventionell flödescytometri inte visuell validering av nyckelhändelser 9,10.
Därför har avbildningsflödescytometri (IFC) undersökts för att utföra MN-analysen. ImageStreamX Mk II kombinerar hastigheten och den statistiska robustheten hos konventionell flödescytometri med de högupplösta avbildningsfunktionerna hos mikroskopi i ett enda system11. Det har visats att genom att använda IFC kan högupplösta bilder av alla viktiga händelser fångas och automatiskt poängsättas med hjälp av funktionsbaserade 12,13 eller artificiell intelligens (AI) tekniker 14,15. Genom att använda IFC för att utföra MN-analysen kan automatisk poängsättning av många fler celler jämfört med mikroskopi på kortare tid uppnås.
Detta arbete avviker från ett tidigare beskrivet arbetsflöde för bildanalys16 och diskuterar alla steg som krävs för att utveckla och träna en Random Forest (RF) och/eller CNN-modell (Convolutional Neural Network) med hjälp av Amnis AI-programvara (hädanefter kallad “AI-programvara”). Alla nödvändiga steg beskrivs, inklusive att fylla i marksanningsdata med hjälp av AI-assisterade taggningsverktyg, tolkning av modellträningsresultat och tillämpning av modellen för att klassificera ytterligare data, vilket möjliggör beräkning av genotoxicitet och cytotoxicitet15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbetet som presenteras här beskriver användningen av djupinlärningsalgoritmer för att automatisera poängsättningen av MN-analysen. Flera nya publikationer har visat att intuitiva, interaktiva verktyg gör det möjligt att skapa djupinlärningsmodeller för att analysera bilddata utan behov av djupgående beräkningskunskap18,19. Protokollet som beskrivs i detta arbete med hjälp av ett användargränssnittsdrivet mjukvarupaket har utformats för att funger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
