Zecken-Fütterung mit künstlicher Membran für Ixodes scapularis

Summary

Hier wird eine Methode vorgestellt, um Zecken in vitro über ein künstliches Membransystem zu ernähren, um eine teilweise oder vollständige Überfüllung einer Vielzahl von Zeckenlebensstadien zu ermöglichen.

Abstract

Zecken und die damit verbundenen Krankheiten sind aufgrund ihrer Belastung für die öffentliche Gesundheit und die Veterinärmedizin ein wichtiges Studienthema. Der Fütterungsbedarf von Zecken sowohl während der Studie als auch während der Aufzucht kann jedoch experimentelle Fragen oder die Fähigkeit von Laboren, Zecken und die damit verbundenen Krankheitserreger zu erforschen, einschränken. Ein künstliches Membranfütterungssystem kann diese Probleme reduzieren und neue Forschungswege eröffnen, die mit herkömmlichen Tierfütterungssystemen möglicherweise nicht möglich gewesen wären. Diese Studie beschreibt ein künstliches Membranfütterungssystem, das für den Fütterungs- und Schwellungserfolg für alle Lebensstadien von Ixodes scapularis verfeinert wurde. Darüber hinaus kann das in dieser Studie beschriebene künstliche Membranfütterungssystem durch einfache Verfeinerung der gewünschten Membrandicke für die Verwendung mit anderen Zeckenarten modifiziert werden. Die Vorteile eines künstlichen Membranfütterungssystems werden durch die Arbeitsintensität des Systems, die zusätzlichen Umweltfaktoren, die sich auf den Fütterungserfolg auswirken können, und die Notwendigkeit, die Technik für jede neue Art und jedes neue Lebensstadium von Zecken zu verfeinern, aufgewogen.

Introduction

Durch Zecken übertragene Krankheiten haben weltweit starke Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier und waren von 2004 bis 2016 für mehr als zwei Drittel aller vektorassoziierten Erkrankungen in den USA verantwortlich¹. Darüber hinaus sind die Fallzahlen in den letzten Jahren gestiegen, wobei immer mehr Menschen und Nutztiere von Zecken und den damit verbundenen Krankheiten betroffen sind ^2,3. Während es wahrscheinlich zahlreiche Ursachen für den Aufwärtstrend bei den Fallzahlen gibt, ist der Klimawandel ein wichtiger Faktor ^3,4. Der prognostizierte anhaltende Anstieg der Zahl der durch Zecken übertragenen Krankheitsfälle unterstreicht die Notwendigkeit, neue Instrumente zu entwickeln, um die Beziehungen zwischen Zecken und den von ihnen übertragenen Krankheitserregern zu untersuchen.

Es ist bekannt, dass Zecken während der Fütterung Veränderungen in der Physiologie und Genexpression erfahren und dass diese Veränderungen eine Rolle bei der Übertragung von Krankheitserregern spielen ^5,6. Es kann schwierig sein, Studien durchzuführen, die die Auswirkungen der vollständigen und teilweisen Fütterung auf die Übertragung und den Erwerb von Krankheitserregern anhand von Tiermodellen untersuchen, insbesondere in Situationen, in denen Nagetiermodelle nicht anfällig für eine Infektion mit einem bestimmten Erreger sind. Zum Beispiel wird der Stamm Anaplasma phagocytophilum Variant-1 auf natürliche Weise zwischen Ixodes scapularis und Hirschen übertragen, ist aber nicht in der Lage, Mäuse zu infizieren, was die Zeckeninfektion im Labor erschwert⁷. Künstliche Fütterungssysteme können auch eingesetzt werden, um Krankheitserreger wie Borrelia burgdorferi durch den Einsatz transgener Mutanten zu untersuchen, die Gendeletionen aufweisen, die die Übertragung oder Infektion hemmen⁸. Die Verwendung eines künstlichen Fütterungssystems hilft den Forschern, die Rolle der Gene zu isolieren, indem eine Infektion oder Übertragung nur auf der Seite der Zecke stattfindet und dadurch jede Wirtsreaktion isoliert wird, die solche Studien verwirren könnte.

In ähnlicher Weise können einige Lebensstadien von Zecken, die an der Übertragung von Krankheiten und Tieren beteiligt sind, nicht dazu veranlasst werden, sich von gängigen Labormodellarten zu ernähren. Ixodes scapularis-Weibchen zum Beispiel müssen mit größeren Tieren, typischerweise Kaninchen, gefüttert werden⁹. Obwohl sie oft für Laborexperimente zugänglich sind, übersteigen die Verwaltungs- und Haltungsanforderungen für die Verwendung von Kaninchen die von kleinen Nagetieren und können für einige Laboratorien unerschwinglich sein. Andere Zeckenarten, insbesondere solche, die tierärztlich bedenklich sind, müssen mit Rindern oder anderen großen Tieren gefüttert werden, die in den meisten Laboratorien nicht praktikabel sind. In-vitro-Fütterungs – und Infektionsmethoden, wie z. B. künstliche Membranfütterung, bieten Alternativen zur Verwendung großer oder exotischer Wirtstiere.

Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines künstlichen Fütterungssystems bestimmte Analysen, die mit herkömmlichen Tierfütterungsmethoden möglicherweise nicht möglich sind. Ein Beispiel dafür ist, dass durch die Trennung der Blutquelle vom Fütterungsmechanismus die Untersuchung der Rolle, die das Blut verschiedener Wirte bei der Übertragung von B. burgdorferi spielen kann, möglich wird¹⁰. Diese Untersuchung des Wirtsblutes und der Rolle, die das Blut selbst in Abwesenheit der Immunantwort des Wirts spielt, ist ein wichtiger Faktor, um die Übertragungszyklen von Krankheitserregern zu verstehen, und einer, den künstliche Fütterungssysteme beantworten können¹¹. Es wird auch möglich, die genauen Übertragungszahlen eines Erregers während einer Fütterung zu quantifizieren, anstatt nur den Übertragungserfolg und die Etablierung in einem Wirt^{zu untersuchen 8,12}.

Einige der ersten künstlichen Futtermembranen für harte Zecken wurden in den 1950er und 1960er Jahren aus Tierhäuten oder tierischen Membranen hergestellt^13,14. Aufgrund der biologischen Beschaffenheit dieser Membranen gab es Probleme sowohl bei der Herstellung neuer Membranen als auch bei der Haltbarkeit. In den 1990er Jahren wurden vollständig künstliche Membranen entwickelt, die eine Unterlage aus Netz, Papier oder Gewebe mit Silikonimprägnierung verwendeten^15,16. Silikon war ideal, da seine physikalischen Eigenschaften die Dehnbarkeit und leichte Klebrigkeit der Haut sowie seine bioinhärente Natur nachahmen. Darauf aufbauend beschrieben Krober und Guerin, auf deren Arbeit diese Technik basierte, eine silikonimprägnierte Viskosemembran-Fütterungstechnik für die künstliche Ernährung von I. ricinus¹⁷.

Die Verfeinerung der Methoden für I. scapularis, eine eng verwandte Art, hat zu bemerkenswerten Unterschieden in der Härte von Silikon geführt, das bei der Membranimprägnierung verwendet wird, das Rezept für die Membranherstellung, die Abmessungen der Kammer und das Bindungsstimulans. Während die in dieser Studie berichteten Verfeinerungen zu ähnlichen Membraneigenschaften geführt haben wie die von Andrade et al., die auch eine Membran auf Silikonbasis auf der Basis von Krober und Guerin für den Einsatz in I. scapularis entwickelt haben, gibt es einen Unterschied in den Silikonimprägnierschritten, der die Flexibilität ermöglicht, dieses Protokoll für unreife Lebensstadien von I. scapularis¹⁵ zu verwenden. ¹⁸. Auflage. Diese Studie beschreibt auch Ergänzungen und technische Änderungen, die auf der wiederholten Anwendung dieser Methode basieren, Best Practices, die zu einem erfolgreichen Feed führen, und die Behebung von Problemen, die auftreten können. Diese Methode wurde verwendet, um alle aktiven Lebensstadien zu füttern, Zecken mit pathogenen Bakterien zu infizieren und Zecken mehreren Dosierungen von Antibiotika auszusetzen^19,20. Während die gezeigte künstliche Membranfütterungsmethode für I. scapularis gilt, ist diese Methode mit geringfügigen Änderungen der Membrandicke leicht an andere Zeckenarten anpassbar.

Protocol

1. Vorbereitung der Zeckenmembrankammer Bereiten Sie eine flache, nicht poröse Oberfläche vor, z. B. eine Ebene aus Glas oder eine keramikbeschichtete Metallbasis eines Armständers, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen und dann mit einer einzigen Schicht Plastikfolie abdecken, wobei Sie darauf achten, dass die Kunststofffolie flach und ohne Blasen oder Falten ist (siehe Abbildung 1A). Kleben Sie 100% Viskoselinsen-Reinigungspapier auf die vorbereite…

Representative Results

Eine erfolgreiche Fütterung hängt davon ab, ob eine Teil- oder Vollverstopfung gewünscht wird. Erfolgreich gefütterte I. scapularis färben sich für Erwachsene grau und lösen sich von selbst von der Membran. Wenn sie jedoch mindestens erbsengroß sind, können sie sich nach Beendigung der Fütterung von der Membran lösen. Bei unreifen Stadien von I. scapularis variiert die Größe für vollständig geschwollene Zecken, und da sie im Gegensatz zu Erwachsenen keine Farbänderung aufweisen, ist die …

Discussion

Die künstliche Membranfütterung von Zecken ist ein nützliches Werkzeug für eine Vielzahl von experimentellen Verfahren, wird aber wahrscheinlich nicht für alle Anwendungen die Tierfütterung ersetzen. Die Erhaltung großer Zeckenkolonien in allen Lebensstadien ohne Tierfütterung ist in der Regel unhaltbar. Stattdessen ist das künstliche Fütterungssystem für andere Zwecke wertvoll, wie z. B. die Infektion von Zecken mit Krankheitserregern, die nicht von Modellwirten unterstützt werden, die Bewertung der Auswirku…

Materials

00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA