3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)
Summary
粒状足場内の粒子画分のばらつきを最小限に抑えることで、再現性のある実験が容易になります。この研究では、 in vitro 組織工学アプリケーション向けに、制御された粒子画分を使用して粒状足場を生成する方法について説明します。
Abstract
ミクロゲルは、微多孔性アニール粒子(MAP)足場の構成要素であり、in vitro 細胞培養と in vivo 組織修復の両方のプラットフォームとして機能します。これらの顆粒状足場では、ミクロゲル間の空隙空間によって生成される生来の多孔性により、細胞の浸潤と遊走が可能になります。空隙率は細胞の生理活性の手がかりであるため、空隙率と粒子画分を制御することはMAP足場の設計にとって重要です。球状ミクロゲルは、制御されたサイズおよび形状のためにマイクロ流体デバイス上で生成し、続いてポリマーネットワークの破砕を防止する方法を用いて凍結乾燥することができる。再水和すると、凍結乾燥されたミクロゲルはMAP足場に制御された粒子画分をもたらす。ミクロゲル凍結乾燥のためのこれらの方法の実施は、高分子拡散および細胞拡散に対する粒子画分の効果を示す再現性のある研究につながった。次のプロトコルは、MAP足場内の粒子画分を制御するためのミクロゲルの製造、凍結乾燥、および再水和、およびin vitroでの3D細胞培養のためのバイオ直交架橋によるミクロゲルのアニーリングをカバーします。
Introduction
微多孔性アニール粒子(MAP)足場は、ミクロゲル(μgel)ビルディングブロックが相互結合してバルクの多孔質足場を形成する粒状材料のサブクラスです。これらの顆粒状スキャフォールドのユニークなマイクロアーキテクチャにより、連結された球状ミクロゲル間の空隙空間によって生成される生来の多孔性は、加速された細胞浸潤と遊走をサポートします1。MAP足場のミクロゲルビルディングブロックは、化学修飾された合成ポリマーと天然ポリマーの両方から製造できます2。ここで説明する方法は、官能性ノルボルネン(NB)ハンドルで修飾されたヒアルロン酸(HA)骨格からなるミクロゲルの使用を特に強調している。HAポリマーのNB機能ハンドルは、ミクロゲルを形成し、それらを結合してMAP足場を生成するためのクリック化学反応をサポートします3,4。ミクロゲルを一緒に連結(すなわち、アニーリング)するために、酵素1、光ベースの5,6、および無添加クリックケミストリー3,7反応などの多数のスキームが採用されている。この研究では、HA-NBミクロゲルを相互結合するためのテトラジン-ノルボルネン逆電子要求ディールス-アルダー共役を使用して、無添加クリック化学について説明します。
MAPスキャフォールドを製造するために、ユーザーはまず、バッチシステムまたはマイクロ流体デバイス内で逆エマルジョンを使用し、電気流体力学的スプレー、リソグラフィー、または機械的フラグメンテーションを使用してミクロゲルビルディングブロックを生成します2。球状HA−NBミクロゲルの製造は、バッチエマルジョン2およびマイクロ流体液滴生成技術の両方を用いて十分に記載され、以前に報告されている8、9、10、11。この研究では、球状HA-NBミクロゲルを、前述のように、制御されたサイズおよび形状のためのフロー集束マイクロ流体プラットフォーム上に生成した8,9,10。精製後、ミクロゲルは水性懸濁液中に存在し、詰まった状態を誘発するために濃縮されなければならない。詰まると、ミクロゲルはせん断減粘特性を示し、注射可能な空間充填材料として機能することができます1。詰まった状態を誘発する1つの方法は、凍結乾燥、または凍結乾燥を介してミクロゲルを乾燥させ、続いて乾燥生成物を制御された容量12で再水和することである。あるいは、過剰な緩衝液は、ストレーナー上での遠心分離によって、または吸引または吸収材料を使用してミクロゲルペレットから緩衝液を手動で除去することによって、ミクロゲルスラリーから除去することができる。しかしながら、ミクロゲルを乾燥させるために遠心分離を使用すると、顆粒足場を作製するときに非常に可変な範囲の粒子画分および空隙画分を生成することができる12。ミクロゲルを凍結乾燥するための技術は、ポリエチレングリコール(PEG)ミクロゲル13のための70%IPA、ゼラチンメタクリロイル(GelMa)ミクロゲル14のためのフッ素化油、およびHAミクロゲル12のための70%エタノールを用いて記載されている。このプロトコルは、乾燥プロセス中に元のミクロゲルの特性を保持するために、標準的な実験室用試薬である70%エタノールを使用して球状HAミクロゲルを凍結乾燥する方法を強調しています。凍結乾燥HAミクロゲルは、MAP足場12における最終粒子画分を制御するために、ユーザー定義の重量百分率で秤量および再水和することができる。
MAP足場形成の最終ステップは、ミクロゲルをアニーリングしてバルクの多孔質足場1を作成することに依存しています。MAPスキャフォールドは、天然の細胞外マトリックス成分を利用し、バイオ直交アニーリングスキームを採用することにより、in vitro 細胞培養と in vivo 組織修復の両方のための生体適合性プラットフォームとして機能します3。これらのアプローチにより、MAP足場は、組織工学アプリケーションで使用するために、ユーザー定義の粒子画分を備えたHA-NBビルディングブロックから製造できます12。以下のプロトコルは、MAP足場における粒子画分を制御するための凍結乾燥および再水和に続くHA-NBミクロゲルのマイクロ流体製造について説明する。最後に、ミクロゲルをアニーリングするためのステップは、 in vitro 3D細胞培養実験のためのバイオ直交化学を使用して説明されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
HA−NBミクロゲルのマイクロ流体生産は、エマルジョンバッチ生産よりも狭い範囲のサイズ分布を有するミクロゲルを生成することが示されている3、9。このプロトコルに記載されているミクロゲルは、材料分解をサポートするためにMMP切断可能な架橋剤(Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)を使用して処方されました。しかしながら、HA−NBミクロゲルは、非?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、国立衛生研究所、国立神経障害および脳卒中研究所(1R01NS112940、1R01NS079691、R01NS094599)、および国立アレルギー感染症研究所(1R01AI152568)に感謝の意を表したい。この作業の一部は、全米ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ(NNCI)の一部として国立科学財団(賞番号ECCS-2025064)によってサポートされているノースカロライナリサーチトライアングルナノテクノロジーネットワーク(RTNN)のメンバーであるデューク大学共有材料計装施設(SMIF)で実施されました。著者らは、細胞培養実験用の3Dプリントデバイスの生成を支援してくれたラボの元ポスドクであるルーカスシルマー博士とイーサンニックロウに感謝したいと思います。
Materials
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
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