Påvisning af unormalt prionprotein ved immunhistokemi

Summary

Immunmærkning af unormalt prionprotein ved hjælp af immunhistokemiske protokoller kræver specifikke prøve- og anti-PrP-antistofpræparationsmetoder. Denne protokol beskriver de vigtigste trin i epitopmaskering for at sikre korrekt PrP-immunmærkning og for at minimere ikke-specifik baggrundsfarvning. Denne tilgang overvejer også biosikkerhedsforanstaltninger ved udførelse af immunhistokemiske undersøgelser med de prioninficerede væv.

Abstract

Unormale prionproteiner (PrP^Sc) er den sygdomsassocierede isoform af cellulært prionprotein og diagnostiske markører for transmissible spongiforme encephalopatier (TSE’er). Disse neurodegenerative sygdomme påvirker mennesker og flere dyrearter og omfatter scrapie, zoonotisk bovin spongiform encephalopati (BSE), chronic wasting disease hos hjortedyr (CWD) og den nyligt identificerede kamelprionsygdom (CPD). Diagnosticering af TSE er afhængig af immunpåvisning af PrP^Sc ved anvendelse af både immunhistokemi (IHC) og vestlige immunoblotmetoder (WB) på encefalonvæv, nemlig hjernestammen (obex-niveau). IHC er en meget anvendt metode, der bruger primære antistoffer (monoklonale eller polyklonale) mod antigener af interesse i celler i en vævssektion. Antistof-antigenbindingen kan visualiseres ved en farvereaktion, der forbliver lokaliseret i det område af vævet eller cellen, hvor antistoffet var målrettet. Som sådan anvendes immunhistokemiske teknikker i prionsygdomme som inden for andre forskningsområder ikke kun til diagnostiske formål, men også i patogeneseundersøgelser. Sådanne undersøgelser involverer påvisning af PrP^Sc-mønstre og -typer fra dem, der tidligere er beskrevet, for at identificere de nye prionstammer. Da BSE kan inficere mennesker, anbefales det, at faciliteter og/eller praksis på biosikkerhedslaboratorieniveau 3 (BSL-3) anvendes til håndtering af kvæg, små drøvtyggere og hjortedyrprøver, der indgår i TSE-overvågningen. Derudover anbefales indeslutnings- og priondedikeret udstyr, når det er muligt, for at begrænse kontaminering. PrP^Sc IHC-proceduren består af et myresyreepitop-demmaskeringstrin, der også fungerer som en prioninaktiveringsforanstaltning, da formalinfikseret og paraffinindlejret væv, der anvendes i denne teknik, forbliver smitsomt. Ved fortolkning af resultaterne skal man sørge for at skelne ikke-specifik immunmærkning fra målmærkning. Til dette formål er det vigtigt at genkende artefakter af immunmærkning opnået i kendte TSE-negative kontroldyr for at skelne dem fra specifikke PrP Sc-immunmærkningstyper, som kan variere mellem TSE-stammer, værtsarter og prnp-genotype, yderligere beskrevet heri.

Introduction

Ifølge prionhypotesen er den abnorme isoform (PrP^Sc) den primære eller eneste komponent i det infektiøse agens i transmissible spongiforme encephalopatier (TSE’er). Bekræftelse til diagnosticering af TSE afhænger af immunpåvisning af PrP^Sc ved anvendelse af immunhistokemiske (IHC) protokoller og/eller vestlige immunblotmetoder (WB) af encefalonvæv¹.

IHC er en metode, der anvender monoklonale eller i nogle tilfælde polyklonale antistoffer (som primære antistoffer) som et første trin i immunfarvning af specifikt målrettede antigener af interesse placeret i celler i en vævssektion. Enhver effektiv primær antistof-antigenbinding visualiseres derefter ved hjælp af sekundære antistoffer, der er specifikke for de primære antistoffer. Disse sekundære antistoffer konjugeres til enzymer, såsom peberrodsperoxidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP). Visualisering opnås derefter ved at tilføje et substrat til disse enzymer, der producerer uopløselige farveprodukter lokaliseret i områder, hvor de primære antistoffer er bundet til de målrettede antigener. Forbedret visualisering kan opnås ved modfarvning, hvor et farvestof bruges til at skabe en kontrast mellem immunmærket og ikke-immunmærket væv².

Ved IHC ved anvendelse af formalinfikseret paraffinindlejret væv (FFPE) kan formalinfiksering ophæve effektiviteten af primære antistoffer på grund af tværbinding med formaldehyd og opvarmning og dehydrering under paraffinindlejring. Disse ændrer konformationen af proteiner, ødelægger, denaturerer eller maskerer epitoperne og mindsker eller ophæver dermed deres påvisning³. Som sådan kræver dette antigenhentning (AR). AR-teknikkerne forstyrrer formaldehydrelateret kemisk gruppetværbinding i de antigene molekyler og genopretter eller afslører således den oprindelige antigen-proteinkonformation. Dette resulterer i at genvinde antistof-antigen (epitop) affinitet til immunmærkning. Den endelige effekt af AR afhænger af kvaliteten af det målrettede antigen og / eller det primære antistof².

Varmeinduceret antigen (epitop) hentning (HIER) er en procedure i AR³ og anvendes rutinemæssigt til PrP^Sc IHC-detektion, som beskrevet heri. IHC er afgørende for diagnose og anvendes i forskningslaboratorier til at bestemme vævsfordelingen af et patologiassocieret antigen. Det bruges i vid udstrækning til diagnosticering og forskning i kræft, neurovidenskab og infektionssygdomme⁴, blandt andre. For TSE spiller IHC en vigtig rolle i diagnosticering og forskning til bekræftelse og undersøgelse af PrP^Sc-fordeling i naturlige værter og eksperimentelle modeller. IHC bidrager til prionpatogeneseundersøgelser og analyse af PrP Sc-aflejringstyper og -mønstre, nemlig i neurale væv⁵, for at påvise afvigelser fra rutinemæssigt beskrevne infektioner og identificere formodede nye prionstammer.

Da prioner af bovin spongiform encephalopati (BSE) kan inficere mennesker, kan visse laboratorieprotokoller, der er involveret i arbejdet med BSE, kræve anvendelse af BSL-3-faciliteter og -praksis⁶. Disse omfatter anvendelse af en forseglet sekundær beholder til transport af potentielle BSE-inficerede vævsprøver inden for instituttet og laboratoriet. Det omfatter også udpegelse af indeslutningsområder og prionsærligt udstyr til BSE-forskning og -analyse, når det er muligt. Dette gøres for at forhindre kontaminering uden for arbejdsområdet og give et begrænset rum, da dekontamineringsprocedurer bliver nødvendige.

I overensstemmelse hermed følger laboratoriet for patologi i INIAV anbefalede faciliteter og praksis for biosikkerhedsniveau-3 (BSL-3)⁶ for at håndtere potentielle prioninficerede prøver af væv fra kvæg, små drøvtyggere og hjortedyr, der er forbundet med TSE-overvågningen.

Formalinfikseret og paraffinindlejret væv, der indgår i TSE-diagnosticerings- eller forskningsprocedurer, især i centralnervesystemet, kan være potentielt smitsomt. Derfor skal disse faste væv behandles med myresyre for at reducere smitsomheden af prioner, hvis de er til stede, før vævsbehandling. Dette udføres ved at placere faste, trimmede væv (ca. 2-4 mm tykkelse) i en behandlingskassette. Kassetten nedsænkes derefter i 98% myresyre (i 1 time). Efter nedsænkning vaskes kassetterne med væv i rindende ledningsvand i 30 minutter og returneres til fikseringsmidlet inden videre behandling. Hvis vævssektioner ikke behandles før behandling, skal postmikrotomiske vævssektioner nedsænkes i ufortyndet myresyre i mindst 5 minutter før histologisk farvning⁷. IHC-protokollen for PrP^Sc inkluderer et rutinemæssigt myresyreepitop-demmaskeringstrin, der også tjener til at inaktivere prioner⁷. Efter disse prioninaktiveringstrin kan det resulterende faste væv derefter behandles ved BSL-2 ved hjælp af standard BSL-2-praksis.

Minimumskravet til vævsprøvetagning til TSE-diagnosticering hos alle dyr, der er omfattet af TSE-overvågningen, er indsamling af hjernestammen (på obex-niveau). For at påvise atypisk BSE og scrapie anbefales det desuden, at en del af lillehjernen også indsamles ^1,8. Til CWD-diagnose bør både hjernestamme (obex) og retropharyngeale lymfeknuder testes, da PrP Sc kunne påvises i lymfoide væv uden påviselig PrP^Sc i obex⁹, gennemgået af Machado et ^al.10.

Den obex-del af hjernestammen omfatter diagnostiske TSE-målsteder, nemlig dorsal vagalkernen (DVN), ensomhedskanalkernen (STN) og rygmarvskernen i trigeminusnerven (V). Disse områder udviser konsekvent bilateral akkumulering af PrP^Sc , selv i de tidlige stadier af BSE og klassisk scrapie. I kliniske tilfælde af fremskreden TSE viser alle gråstofområder i hjernestammen udbredt PrP^{Sc-fordeling 11}.

Før sektionering og behandling evalueres hjerneprøverne (figur 1) for at fastslå autolyseniveauet og tilstedeværelsen af eventuelle vævsskader, der potentielt kan kompromittere prøvens egnethed til IHC-baseret bekræftende diagnose⁸. For at validere integriteten af de præparative protokoller og analyseresultaterne indgår TSE-positive og negative vævsprøver som kontroller i forbindelse med fremstilling af væv fra testtilfælde i hvert assay.

Figur 1: PrP^Sc IHC-proceduren. Repræsentation, der viser den trinvise sekvens af PrP^Sc IHC-proceduren fra deparaffinisering af vævssektioner til eventuel immunfarvning og detektion (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – monoklonalt antistof; DAB – 3,3′ diaminobenzidin). Denne figur blev oprettet i BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

IHC-proceduren, der er beskrevet heri, er en del af forskningsprojektet FAIRJ-CT98-7021, “Etablering af et europæisk netværk til overvågning af TSE hos drøvtyggere og standardisering og harmonisering af processen og kriterierne for identifikation af mistænkte tilfælde”. Det følger de diagnosekriterier, der er fastlagt af Verdensorganisationen for Dyresundhed, WOAH (tidligere benævnt Det Internationale Kontor for Epizootier, OIE)1 og Det Europæiske Referencelaboratorium for TSE hos Dyr<sup…

Representative Results

Da ikke-specifik målimmunmærkning er mulig, er det vigtigt at fastslå niveauet for ikke-specifik immunmærkning hos kendte TSE-negative kontroldyr. Dette er et vigtigt skridt til korrekt fortolkning af specifik PrPSc-immunmærkning 7 (figur 2). Ikke-målmærkning med anti-PrP-antistoffer er blevet bemærket at forekomme som diskret intraneuronal finpartikelfarvning (mere tydelig i hypoglossalkernen og tilbehørscuneatkernen), uregelmæssige fin…

Discussion

TSE er potentielle zoonotiske sygdomme. Efter fremkomsten af BSE i 1986 i Det Forenede Kongerige blev Portugal en af de EU-medlemsstater, der havde en højere forekomst af denne sygdom^14,15. For at bekæmpe denne sygdom er der udviklet andre TSE’er (klassisk og atypisk scrapie, BSE-varianter og i øjeblikket overvågning af chronic wasting disease hos hjortedyr), overvågningsmekanismer af Generaldirektoratet for Fødevarer og Veterinær (DGAV) og National Instit…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted