リ ケッチア 属菌を蛍光タンパク質発現シャトルベクターでダニ細胞株に形質転換するエレクトロポレーション法
Summary
エレクトロポレーションは、外因性DNAを リケッチア属に導入するための迅速で広く採用されている方法です。このプロトコルは、 リケッチア属における偏性細胞内細菌の形質転換のための有用なエレクトロポレーション法を提供する。
Abstract
リケッチア症は、感染した節足動物ベクターの咬傷を介して脊椎動物の宿主に伝染する可能性のある リケッチア 属に属する広範囲の偏性細胞内細菌によって引き起こされます。今日まで、新興または再出現の流行性リケッチアは、診断方法が限られており、標準化されておらず、普遍的にアクセスできないため、診断が困難なため、公衆衛生上のリスクのままです。徴候や症状の認識の欠如に起因する誤診は、抗生物質治療の遅れや健康状態の悪化につながる可能性があります。 リケッチア の特徴を包括的に理解することで、最終的には臨床診断、評価、および治療が改善され、病気の制御と予防が改善されます。
リケッチア遺伝子の機能的研究は、病因におけるリケッチア遺伝子の役割を理解するために重要です。本論文では、シャトルベクターpRAM18dSFAを用いたリケ ッチア・パーケリ 株Tate’s Hellのエレクトロポレーションの手順と、抗生物質(スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン)によるダニ細胞培養における形質転換 R. parkeri の選択について説明します。共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてダニ細胞における形質転換 R.パーケリ の局在化のための方法も記載されており、ベクター細胞株における形質転換を確認するための有用な技術である。同様のアプローチは、他のリケッチアの形質転換にも適しています。
Introduction
リケッチア症は、リケッチア属(リケッチア科、リケッチア目)に属する広範囲の偏性細胞内細菌によって引き起こされます。リケッチア属は、系統学的特徴に基づいて4つの主要なグループに分類されます1,2:最も重篤で致命的なダニ媒介性リケッチアを引き起こすリケッチアを含む斑点熱グループ(SFG)、チフスグループ(TG、例えば、流行性発疹チフスの病原体であるリケッチアプロワゼキイ)、 移行群(TRG、例えば、ノミ媒介性紅斑熱の原因物質であるリケッチア・フェリス)、および祖先群(AG、例えば、リケッチア・ベリイ)。
最も古い既知のベクター媒介性疾患の中で、リケッチア症は主に、ダニ、ノミ、シラミ、ダニなどの感染した節足動物ベクターの咬傷を介した病原体の伝染に続いて獲得されます3,4。効果的な抗菌薬の発見は治療成績を改善しましたが、新興および再出現の流行性リケッチア症は、従来の予防および管理戦略に挑戦し続けています。したがって、リケッチア/宿主/ベクター相互作用の包括的な理解は、最終的にこれらの古代の病気を予防および治療するための新しいアプローチを開発するための強力な基盤を確立するでしょう。
自然界では、細菌の遺伝子水平伝播(HGT)は、結合、形質導入、および形質転換によって発生します5。インビトロ細菌形質転換はこれらのHGTの概念を利用しますが、リケッチアの細胞内性質にはいくつかの課題があります。異なる種のリケッチアにおける成長条件の制限とよく理解されていない抱合および形質導入システムは、リケッチアにおける接合および形質導入法の適用を妨げている6,7,8。他の偏性細胞内細菌属(クラミジア、コクシエラ、アナプラズマ、エールリキアなど)と比較して、リケッチア属は細胞質内の成長および複製戦略に関して異なり、その独特のライフスタイルの特徴のためにリケッチアの遺伝子組み換えに特定の課題を課します9。
リケッチアの遺伝子組み換えを試みる際に克服すべき最初のハードルは、形質転換を成功させることです。したがって、高い形質転換効率で実現可能なアプローチを設計することは、リケッチアの遺伝子ツールを開発する上で非常に価値があります。ここでは、リケッチア・プロワゼキイ、リケッチア・チフス、リケッチア・コノリイ、リケッチア・パーケリ、リケッチア・モンタネンシス、リケッチア・ベリー、リケッチア・ピーコッキイ、リケッチア・ブフネリなど、いくつかの種のリケッチアに外因性DNAをうまく導入するために使用されている広く認識されている形質転換法であるエレクトロポレーションに焦点を当てます10,11,12 、13,14,15,16。
本論文では、遠赤色蛍光タンパク質であるmKATEとスペクチノマイシン耐性を付与するように設計されたaaR/SCプラスミドpRAM18に由来するシャトルベクターpRAM18dSFAを用いて、R.パーケリ株Tate’s Hell(アクセッション:GCA_000965145.1)のエレクトロポレーションの手順について説明します13,15,20。形質転換されたR.パーケリは、ダニ細胞株における抗生物質選択下で生存および安定に維持される。さらに、共焦点顕微鏡による生きたダニ細胞における形質転換R. parkeriの局在化が、ベクター細胞株の形質転換率の質を評価するために使用できることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、シャトルプラスミドpRAM18dSFAにコードされた外因性DNAをエレクトロポレーションを用いてリケッチアに導入する方法を実証する。この手順では、無細胞リケッチアを宿主細胞から精製し、リケッチアシャトルベクターで形質転換し、感染のためにダニ細胞上に放出した。また、ダニ細胞における赤色蛍光タンパク質発現 R.パーケリ を検出するための共焦点免疫蛍光手順も記?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ティモシー・J・クルッティとベンジャミン・カルの洞察に満ちた議論と提案に感謝します。この研究は、NIHからのU.G.M.への助成金(2R01AI049424)とミネソタ農業試験場からのU.G.M.への助成金(MIN-17-078)によって財政的に支援されました。
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
References
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
