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Biologie

インシリコで 宿主-病原体相互作用におけるcircRNAの同定と特性評価

Published: October 21, 2022
doi:
10.3791/64565
, , ,
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science,Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR),Universiti Malaya

Summary

ここで提出されたプロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するRNAシーケンシングトランスクリプトームデータからcircRNAを予測し、機能的に特徴付けるために必要な完全な インシリコ パイプラインを説明しています。

Abstract

環状RNA(circRNA)は、バックスプライシング によって 形成されるノンコーディングRNAの一種です。これらのcircRNAは、主に様々な生物学的プロセスの調節因子としての役割について研究されています。特に、病原体(インフルエンザやコロナウイルスなど)に感染すると宿主のcircRNAが差次的に発現(DE)できることが新たな証拠で示されており、宿主の自然免疫応答の調節におけるcircRNAの役割が示唆されています。しかし、病原性感染におけるcircRNAの役割に関する研究は、RNAシーケンシング(RNA-seq)データからDE circRNAを同定するために必要なバイオインフォマティクス解析を実行するために必要な知識とスキルによって制限されています。バイオインフォマティクスの予測とcircRNAの同定は、検証、および費用と時間のかかるウェットラボ技術を使用した機能研究の前に重要です。この問題を解決するために、RNA-seqデータを使用したcircRNAの インシリコ 予測と特性評価の段階的なプロトコルが本稿で提供されています。プロトコルは4つのステップに分けることができます:1)CIRIquantパイプライン を介した DE循環RNAの予測と定量。2)circBase を介した アノテーションとDEサーキットRNAの特性評価。3)Circrパイプラインを介したCircRNA-miRNA相互作用予測。4)遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)を用いたcircRNA親遺伝子の機能強化解析。このパイプラインは、宿主と病原体の相互作用におけるcircRNAの役割をさらに解明するための将来のin vitro および in vivo 研究を推進するのに役立ちます。

Introduction

宿主と病原体の相互作用は、病原体と宿主生物の間の複雑な相互作用を表し、宿主の自然免疫応答を引き起こし、最終的には侵入病原体の除去をもたらします1,2。病原性感染の間、多数の宿主免疫遺伝子が病原体の複製および放出を阻害するように調節される。例えば、病原性感染時に調節される一般的なインターフェロン刺激遺伝子(ISG)には、ADAR1、IFIT1、IFIT2、IFIT3、ISG20、RIG-I、およびOASL 3,4が含まれる。タンパク質をコードする遺伝子に加えて、長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)、マイクロRNA(miRNA)、環状RNA(circRNA)などのノンコーディングRNAも役割を果たし、病原性感染中に同時に制御されることも報告されています5,6,7。主にタンパク質を機能分子としてコードするタンパク質コード遺伝子とは対照的に、ノンコーディングRNA(ncRNA)は転写レベルおよび転写後レベルで遺伝子の調節因子として機能することが知られています。しかし、宿主の免疫遺伝子の制御にノンコーディングRNA、特にcircRNAが関与する研究は、タンパク質をコードする遺伝子と比較して十分に報告されていません。

CircRNAは、バックスプライシング8と呼ばれる非標準的なスプライシングプロセスによって生成される共有結合的に閉じた連続ループ構造によって広く特徴付けられます。バックスプライシングのプロセスは、同族の直鎖RNAのスプライシングプロセスとは異なり、下流のドナー部位を上流のアクセプター部位にライゲーションし、円形の構造を形成します。現在、circRNAの生合成のための3つの異なるバックスプライシングメカニズムが提案されている。これらは、RNA結合タンパク質(RBP)を介した環状化9,10、イントロン対駆動環状化11、およびラリアット駆動環状化12,13,14である。circRNAが円形構造でエンドツーエンドで連結されていることを考えると、それらは正常なエキソヌクレアーゼ消化に対して自然に耐性がある傾向があり、したがって、それらの線形対応物よりも安定であると考えられる15。circRNAによって示される別の共通の特徴は、宿主16における細胞または組織タイプ特異的発現を含む。

その独特な構造と細胞または組織特異的な発現が示すように、circRNAは細胞内で重要な生物学的機能を果たすことが発見されています。今日まで、circRNAの顕著な機能の1つは、マイクロRNA(miRNA)スポンジとしての役割です17,18。circRNAのこの調節的役割は、circRNAヌクレオチドとmiRNAのシード領域との相補的結合を介して生じる。このようなcircRNA-miRNA相互作用は、標的mRNA上のmiRNAの正常な調節機能を阻害し、したがって遺伝子の発現を調節する19,20。さらに、circRNAは、RNA結合タンパク質(RBP)と相互作用し、RNAタンパク質複合体を形成することによって遺伝子発現を調節することも知られています21。circRNAはノンコーディングRNAに分類されますが、circRNAがタンパク質翻訳のテンプレートとして作用できるという証拠もあります22,23,24。

最近、circRNAは、特に宿主とウイルスの間の宿主と病原体の相互作用を制御する上で極めて重要な役割を果たすことが実証されています。一般に、宿主のcircRNAは、侵入する病原体を排除するために宿主の免疫応答を調節するのに役立つと考えられています。宿主免疫応答を促進するcircRNAの例は、Guoらによって報告されたcircRNA_0082633である25。このcircRNAは、A549細胞内のI型インターフェロン(IFN)シグナル伝達を増強し、インフルエンザウイルスの複製を抑制するのに役立ちます25。さらに、Quらは、IFN-βのシグナル伝達因子であるCREB結合タンパク質(CREBBP)の発現を調節することによって免疫を促進する、circRNA AIVRと呼ばれるヒトイントロニックcircRNAも報告しました26,27。しかし、感染時に疾患の病態形成を促進することが知られているcircRNAも存在する。例えば、Yuらは最近、宿主細胞オートファジーの阻害を通じてH1N1ウイルス複製を促進する上で、2A遺伝子を含むGATAジンクフィンガードメイン(circGATAD2A)からスプライシングされたcircRNAが果たす役割を報告した28。

circRNAを効果的に研究するために、通常、ゲノムワイドなcircRNA予測アルゴリズムが実装され、その後、機能研究を実施する前に、予測されたcircRNA候補の インシリコ 特性評価が行われます。circRNAを予測および特性評価するためのこのようなバイオインフォマティクスアプローチは、コストが低く、時間効率が高くなります。これは、機能的に研究される候補の数を絞り込むのに役立ち、新しい発見につながる可能性があります。ここでは、宿主と病原体の相互作用中のcircRNAのイン シリコ 同定、特性評価、および機能アノテーションのための詳細なバイオインフォマティクスベースのプロトコルを提供します。このプロトコルには、RNAシーケンシングデータセットからのcircRNAの同定と定量、circBase を介した アノテーション、およびcircRNAの種類、重複する遺伝子の数、および予測されるcircRNA-miRNA相互作用の観点からのcircRNA候補の特性評価が含まれます。この研究はまた、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子とゲノムの百科事典(KEGG)エンリッチメント分析を通じて、circRNA親遺伝子の機能アノテーションを提供します。

Protocol

このプロトコルでは、インフルエンザAウイルスに感染したヒトマクロファージ細胞から調製した匿名化されたリボソームRNA(rRNA)枯渇RNA-seqライブラリデータセットをダウンロードし、遺伝子発現オムニバス(GEO)データベースから使用しました。circRNAの予測から機能特性評価までのバイオインフォマティクスパイプライン全体を 図1にまとめます。パイプラインの各部分に…

Representative Results

前のセクションで参加したプロトコルは、Linux OS システムに合わせて変更および構成されました。主な理由は、circRNAの分析に関与するほとんどのモジュールライブラリとパッケージは、Linuxプラットフォームでしか動作しないことです。この分析では、インフルエンザAウイルスに感染したヒトマクロファージ細胞から調製された非同定リボソームRNA(rRNA)枯渇RNA-seqライブラリデータセットをGE…

Discussion

このプロトコルの有用性を説明するために、インフルエンザAウイルス感染ヒトマクロファージ細胞由来のRNA−seqを例として使用した。宿主と病原体の相互作用において潜在的なmiRNAスポンジとして機能するCircRNAと、宿主内でのGOおよびKEGGの機能強化を調べました。オンラインで入手できるさまざまなcircRNAツールがありますが、それぞれが互いに相互作用しないスタンドアロンパッケージで?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、この原稿の批判的なレビューについて、Tan KeEnとCameron Bracken博士に感謝したいと思います。この研究は、基礎研究助成スキーム(FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15)およびマラヤ大学ハイインパクト研究助成金(UM)からの助成金によってサポートされました。C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07)。

Materials

Bedtools GitHub https://github.com/arq5x/bedtools2/ Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWA Burrows-Wheeler Aligner http://bio-bwa.sourceforge.net/ Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Circr GitHub https://github.com/bicciatolab/Circr Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquant GitHub https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs
Clusterprofiler GitHub https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPU Intel  Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)  Specifications used to run this entire protocol.
Cytoscape Cytoscape https://cytoscape.org/download.html Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQC Babraham Bioinformatics https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2 http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Linux Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) https://releases.ubuntu.com/focal/ Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRanda http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtools pybedtools 0.8.2 https://pypi.org/project/pybedtools/ Needed for BED file genomic manipulation
Python Python 2.7 and 3.6 or abover https://www.python.org/downloads/ To run necessary library modules
R The Comprehensive R Archive Network https://cran.r-project.org/ To manipulate dataframes
RNAhybrid BiBiServ https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudio RStudio https://www.rstudio.com/ A workspace to run R
samtools  SAMtools http://www.htslib.org/ Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTie Johns Hopkins University: Center for Computational Biology http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScan GitHub https://github.com/nsoranzo/targetscan Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
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Citer Cet Article
Ealam Selvan, M., Lim, K. S., Teo, C. H., Lim, Y. In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (188), e64565, doi:10.3791/64565 (2022).
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