아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현
Summary
다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
고저항 장벽을 형성하는 것 외에도 신장 골반, 요관, 방광 및 근위 요도를 둘러싸고 있는 요로상피는 환경에 대한 정보를 감지하고 기저 조직으로 전달하여 배뇨 기능과 행동을 촉진하는 것으로 가정됩니다. 요로상피장벽 또는 감각/변환기 기능의 파괴는 질병을 유발할 수 있습니다. 이러한 복잡한 사건을 연구하는 것은 요로상피에서 유전자와 단백질 발현을 변화시키는 간단한 전략이 없기 때문에 방해를 받습니다. 연구자가 다량의 고역가 아데노바이러스를 생성할 수 있도록 하는 방법이 여기에 설명되어 있으며, 이를 사용하여 설치류 요로상피를 고효율로 비교적 간단한 방식으로 형질도입할 수 있습니다. cDNA와 작은 간섭 RNA는 모두 아데노바이러스 형질도입을 사용하여 발현될 수 있으며, 요로상피 기능에 대한 이식유전자 발현의 영향은 12시간에서 며칠 후에 평가할 수 있습니다. 이러한 방법은 마우스 또는 쥐 동물 모델을 사용한 정상 및 비정상 요로상피 생물학 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
Introduction
요로상피(urothelium)는 신장 골반, 요관, 방광, 근위 요도를 둘러싸고 있는 특수 상피이다1. 그것은 3 개의 지층으로 구성되어 있습니다 : 고도로 분화되고 분극화 된 종종 이중 핵 우산 세포의 층으로, 정점 표면은 소변으로 목욕됩니다. 이들의 급성 손실에 반응하여 표재성 우산 세포를 발생시킬 수 있는 이핵-전이-증폭 세포의 집단을 갖는 중간 세포층; 및 기저 세포의 단일 층, 그 하위 집합은 만성 손상에 대한 반응으로 요로 상피 전체를 재생할 수 있는 줄기 세포로 기능합니다. 우산 세포는 주로 고내성 요로상피 장벽을 형성하는 역할을 하며, 그 구성 요소에는 물과 용질에 대한 투과성이 낮은 정점막(콜레스테롤과 세레브로사이드가 풍부함)과 고저항 정점 접합 복합체(밀착 접합부, 부착 접합부, 데스모솜 및 관련 악토미오신 고리로 구성됨)가 포함됩니다.1 . 우산 세포의 정점 표면과 접합 링은 모두 방광 충전 중에 확장되고 1,2,3,4,5를 배뇨한 후 빠르게 미리 채워진 상태로 돌아갑니다. 장벽 기능에서의 역할 외에도 요로피는 세포외 환경의 변화(예: 스트레칭)를 감지하고 매개체(ATP, 아데노신 및 아세틸콜린 포함)의 방출을 통해 이 정보를 전달하여 이 정보를 비뇨상피하 구심성 신경 과정을 포함한 기저 조직으로 전달할 수 있는 감각 및 변환기 기능을 가지고 있다는 가설이 있습니다 6,7,8 . 이 역할에 대한 최근의 증거는 Piezo1과 Piezo2 모두의 요로상피 발현이 결여된 마우스에서 발견되며, 이는 변경된 배뇨 기능을 초래합니다9. 또한, 우산 세포층에서 밀착 접합 기공 형성 단백질인 CLDN2를 과발현하는 쥐는 간질성 방광염 환자에서 볼 수 있는 것과 유사한 염증과 통증을 일으킨다10. 요로상피관/변환기/장벽 기능의 파괴가 여러 방광 장애에 기여할 수 있다는 가설이 있습니다 6,11.
정상 및 질병 상태에서 요로상피의 생물학에 대한 더 나은 이해는 연구자가 내인성 유전자 발현을 쉽게 하향 조절하거나 천연 조직에서 이식유전자의 발현을 허용할 수 있는 도구의 가용성에 달려 있습니다. 유전자 발현을 하향 조절하는 한 가지 접근법은 조건부 요로상피 녹아웃 마우스를 생성하는 것이지만, 이 접근법은 플록스 대립유전자가 있는 마우스의 가용성에 따라 달라지며 노동 집약적이며 완료하는 데 수개월에서 수년이 걸릴 수 있습니다12. 당연히 연구자들은 요로상피를 형질주입하거나 형질도입하는 기술을 개발했으며, 이는 더 짧은 시간 규모로 결과를 가져올 수 있습니다. 형질감염을 위해 공개된 방법은 양이온성 지질13, 안티센스 포스포로티오화 올리고데옥시뉴클레오티드 14, 또는 HIV TAT 단백질 침투 11-mer 펩티드15에 테더링된 안티센스 핵산의 사용을 포함한다. 그러나 이 프로토콜의 초점은 광범위한 세포에 대한 유전자 전달에 효율적인 잘 연구된 방법론인 아데노비랄 매개 형질도입의 사용에 있으며, 수많은 임상 시험에서 테스트되었으며, 가장 최근에는 COVID-19 캡시드 단백질을 암호화하는 cDNA를 COVID-19 백신의 한 변종 수혜자에게 전달하는 데 사용되었습니다16, 17. 아데노바이러스 수명 주기, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스의 임상적 적용에 대한 보다 자세한 설명은 독자가 참조17을 참조하도록 지시합니다.
요로상피를 형질도입하기 위한 아데노바이러스 사용의 중요한 이정표는 Ramesh et al. N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)를 포함한 세제로 짧은 전처리가 β-갈락토시다아제를 암호화하는 아데노바이러스에 의한 요로상피의 형질도입을 극적으로 향상시켰습니다18. 이 원리 증명 연구를 지침으로 사용하여 요로상피의 아데노비랄 매개 형질도입은 이제 Rab-family GTPases, 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자, 미오신 운동 단편, 기공 형성 밀착 접합 관련 클라우딘 및 ADAM17 10,19,20,21,22 . 동일한 접근법이 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하도록 조정되었으며, 그 효과는 이식유전자22의 siRNA 내성 변이체를 공동 발현함으로써 구출되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 이러한 기술에 대한 요구 사항인 고농축 아데노바이러스를 대량으로 생성하는 일반적인 방법과 요로상피에서 이식유전자를 고효율로 발현하기 위한 Ramesh et al.18의 방법의 적응이 포함됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ramesh et al. 방광암 치료에 아데노바이러스 형질도입을 사용하기 위한 전략 개발에 초점을 맞추었지만 18, 보다 최근의 보고서에서는 정상적인 요로상피 생물학/생리학 및 병태생리학을 연구하는 데 이러한 기술의 유용성을 입증했습니다 10,18,19,20,21 . 이 접?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 P30DK079307(MGD에게), NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에), NIH 보조금 R01DK129473(GA에), 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters Foundation 보조금(NM)을 통한 파일럿 프로젝트 상, 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어, 그리고 S10OD028596(G.A.에게)에 의해, 이 원고에 제시된 이미지 중 일부를 캡처하는 데 사용되는 컨포칼 시스템의 구매 자금을 지원했습니다.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
References
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