Ekspresjon av transgener i naturlig blære urotel ved bruk av adenovirusmediert transduksjon

Summary

Metoder er beskrevet for generering av store mengder rekombinante adenovirus, som deretter kan brukes til å transducere det opprinnelige gnagerurotelet som muliggjør ekspresjon av transgener eller nedregulering av endogene genprodukter.

Abstract

I tillegg til å danne en høy motstandsbarriere, er urotelet som fôrer nyrebekkenet, urinlederne, blæren og proksimale urinrøret hypoteset for å fornemme og overføre informasjon om miljøet til det underliggende vevet, fremme tømmingsfunksjon og oppførsel. Forstyrrelse av urotelbarrieren, eller dens sensoriske / transduserfunksjon, kan føre til sykdom. Å studere disse komplekse hendelsene hindres av mangel på enkle strategier for å endre gen- og proteinuttrykk i urotelet. Metoder er beskrevet her som gjør det mulig for etterforskere å generere store mengder høytiter adenovirus, som deretter kan brukes til å transdusere gnagerurotel med høy effektivitet, og på en relativt enkel måte. Både cDNA og små forstyrrende RNA kan uttrykkes ved hjelp av adenoviral transduksjon, og virkningen av transgen ekspresjon på urotelfunksjonen kan vurderes 12 timer til flere dager senere. Disse metodene har bred anvendelighet for studier av normal og unormal urotelbiologi ved bruk av muse- eller rottedyrmodeller.

Introduction

Urotelet er det spesialiserte epitelet som strekker nyrebekkenet, urinlederne, blæren og det proksimale urinrøret¹. Den består av tre lag: et lag av svært differensierte og polariserte ofte bi-nukleate paraplyceller, hvis apikale overflater er badet i urin; et mellomliggende cellelag med en populasjon av bi-nukleate transittforsterkende celler som kan gi opphav til overfladiske paraplyceller som svar på deres akutte tap; og et enkelt lag av basale celler, en delmengde som fungerer som stamceller som kan regenerere hele urotelet som respons på kronisk skade. Paraplyceller er hovedsakelig ansvarlige for å danne den høyresistente urotelbarrieren, hvorav komponenter inkluderer en apikal membran (rik på kolesterol og cerebrosider) med lav permeabilitet for vann og løsemidler, og et apikalt krysskompleks med høy motstand (bestående av tette kryss, adherenskryss, desmosomer og en tilhørende aktomyosinring)¹ . Både den apikale overflaten av paraplycellen og dens kryssring utvides under blærefylling og går raskt tilbake til sin ferdigfylte tilstand etter tømming 1,2,3,4,5. I tillegg til sin rolle i barrierefunksjon, er urotelet også antatt å ha sensoriske og transduserfunksjoner som gjør det mulig å oppdage endringer i det ekstracellulære miljøet (f.eks. Stretch) og overføre denne informasjonen via frigjøring av mediatorer (inkludert ATP, adenosin og acetylkolin) til underliggende vev, inkludert suburoteliale afferente nerveprosesser ^6,7,8 . Nyere bevis på denne rollen er funnet hos mus som mangler uroteluttrykk for både Piezo1 og Piezo2, noe som resulterer i endret vannlatingsfunksjon⁹. I tillegg utvikler rotter som overuttrykker det poredannende proteinet CLDN2 i paraplycellelaget betennelse og smerte som er analog med det som ses hos pasienter med interstitiell cystitt¹⁰. Det er en hypotese at forstyrrelse av urotelial sensorisk/transduser eller barrierefunksjon kan bidra til flere blærelidelser ^6,11.

En bedre forståelse av urotelets biologi i normale og sykdomstilstander avhenger av tilgjengeligheten av verktøy som gjør det mulig for etterforskere å lett nedregulere endogent genuttrykk eller tillate ekspresjon av transgener i det opprinnelige vevet. Mens en tilnærming til å nedregulere genuttrykk er å generere betingede urotelial knockoutmus, avhenger denne tilnærmingen av tilgjengeligheten av mus med floxed alleler, er arbeidsintensiv og kan ta måneder til år å fullføre¹². Ikke overraskende da har forskere utviklet teknikker for å transfektere eller transducere urotelet, noe som kan føre til resultater på kortere tidsskala. Publiserte metoder for transfeksjon inkluderer bruk av kationiske lipider¹³, anti-sense fosforothioated oligodeoxynucleotides 14, eller antisense nukleinsyrer bundet til HIV TAT protein penetrerende 11-mer peptid¹⁵. Imidlertid er fokuset i denne protokollen på bruk av adenoviral-mediert transduksjon, en godt studert metodikk som er effektiv ved genlevering til et bredt spekter av celler, har blitt testet i en rekke kliniske studier, og ble nylig brukt til å levere cDNA som koder for COVID-19-kapsidproteinet til mottakere av en variant av COVID-19-vaksinen^{16, 17}. For en grundigere beskrivelse av adenovirusets livssyklus, adenovirale vektorer og kliniske anvendelser av adenovirus, henvises leseren til referanse¹⁷.

En viktig milepæl i bruken av adenovirus for å transducere urotelet, var en rapport fra Ramesh et al. som viste korte forbehandlinger med vaskemidler, inkludert N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dramatisk forbedret transduksjon av urotelet av et adenovirus som koder for β-galaktosidase¹⁸. Ved å bruke denne proof-of-principle-studien som en veiledning, har adenoviral-mediert transduksjon av urotelet nå blitt brukt til å uttrykke en rekke proteiner, inkludert Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidutvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter, poredannende tette kryssassosierte klaudiner og ADAM17 10,19,20,21,22 . Den samme tilnærmingen ble tilpasset for å uttrykke små forstyrrende RNA (siRNA), hvis effekter ble reddet ved å uttrykke siRNA-resistente varianter av transgen²². Protokollen beskrevet her inkluderer generelle metoder for å generere store mengder høykonsentrert adenovirus, et krav til disse teknikkene, samt tilpasninger av metodene til Ramesh et ^al.18 for å uttrykke transgener i urotelet med høy effektivitet.

Protocol

Eksperimenter som involverer generering av adenovirus, som krever BSL2-sertifisering, ble utført under godkjenning fra University of Pittsburgh Environmental Health and Safety kontorer og Institutional Biosafety Committee. Alle dyreforsøk som ble utført, inkludert adenoviral transduksjon (som krever ABSL2-sertifisering), ble gjort i samsvar med relevante retningslinjer / forskrifter i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og dyrevelferdsloven, og under godkjenning av University of P…

Representative Results

Virus forberedelseEt eksempel på virusrensing ved sentrifugering av tetthetsgradient er vist i figur 1A. Det lysrosa båndet, som finnes ved grensesnittet mellom det lastede cellematerialet og 1,25 g/ml CsCl-laget, består hovedsakelig av forstyrrede celler og deres rusk (se magenta pil i figur 1A). Den henter sin rosa farge fra den lille mengden kulturmedium som overføres fra trinn 1.5 i protokollen. Viruspartiklene av interesse, som vise…

Discussion

Mens Ramesh et al. var fokusert på å utvikle strategier for å bruke adenoviral transduksjon i behandlingen av blærekreft 18, har nyere rapporter vist nytten av disse teknikkene i å studere normal urotelbiologi / fysiologi og patofysiologi 10,18,19,20,21 . De viktige funksjonene i denne tilnærmingen inkluderer følgende: (i) I hele…

Materials

10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish – 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter – mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter – rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip – sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip – sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer