Una microsonda de radiometría intratisular para medir la radiación in situ en tejido vivo
Summary
En este artículo, se describe un método para medir la radiación in situ en tejido vivo. Este trabajo incluye detalles de la construcción de sondas a microescala para diferentes mediciones de radiancia e irradiancia, proporciona orientación para el montaje de tejido para la caracterización de la radiación y describe métodos computacionales para analizar los datos resultantes.
Abstract
Los organismos parecen opacos en gran parte porque sus capas externas de tejido se dispersan fuertemente a la luz incidente; Los pigmentos fuertemente absorbentes, como la sangre, suelen tener absorbancias estrechas, de modo que el camino libre medio de la luz fuera de los picos de absorbancia puede ser bastante largo. Como las personas no pueden ver a través del tejido, generalmente imaginan que los tejidos como el cerebro, la grasa y el hueso contienen poca o ninguna luz. Sin embargo, las proteínas opsina fotosensibles se expresan dentro de muchos de estos tejidos, y sus funciones son poco conocidas. La luminosidad interna al tejido también es importante para comprender la fotosíntesis. Por ejemplo, las almejas gigantes son fuertemente absorbentes pero mantienen una densa población de algas en lo profundo del tejido. La propagación de la luz a través de sistemas como sedimentos y biopelículas puede ser compleja, y estas comunidades pueden ser importantes contribuyentes a la productividad del ecosistema. Por lo tanto, se ha desarrollado un método para construir microsondas ópticas para medir la irradiancia escalar (flujo de fotones que interseca un punto) y la irradiancia descendente (flujo de fotones que cruza un plano perpendicularmente) para comprender mejor estos fenómenos dentro del tejido vivo. Esta técnica también es manejable en laboratorios de campo. Estas microsondas están hechas de fibras ópticas tiradas por calor que luego se aseguran en pipetas de vidrio tiradas. Para cambiar la aceptación angular de la sonda, una esfera de 10-100 μm de epoxi curable UV mezclada con dióxido de titanio se asegura al extremo de una fibra tirada y recortada. La sonda se inserta en el tejido vivo y su posición se controla mediante un micromanipulador. Estas sondas son capaces de medir in situ la radiación tisular a resoluciones espaciales de 10-100 μm o en la escala de células individuales. Estas sondas se utilizaron para caracterizar la luz que llega a las células adiposas y cerebrales a 4 mm por debajo de la piel de un ratón vivo y para caracterizar la luz que alcanza profundidades similares dentro del tejido de almeja gigante rico en algas vivas.
Introduction
Sorprendentemente, los animales terrestres y los habitantes poco profundos del océano tienen suficiente luz dentro de su cuerpo para la fisiología visual e incluso la fotosíntesis. Por ejemplo, los niveles de luz en el centro de la cabeza de un ratón (fuera de las fuertes bandas de absorbancia de hemoglobina) se atenúan en tres o cuatro órdenes de magnitud en relación con el mundo exterior. Esta es aproximadamente la diferencia entre los niveles de luz en interiores y exteriores. Por lo tanto, la opacidad de un tejido o material debido a una fuerte dispersión no es lo mismo que la opacidad debido a la fuerte absorción de luz. La luz puede seguir propagándose a largas distancias en un sistema de fuerte dispersión hacia adelante, similar a la luz que se propaga a través de sistemas acuáticos con altas concentraciones de células y partículas1. Esta observación es particularmente notable a la luz del hecho de que las proteínas opsinas se expresan casi ubicuamente en todos los tejidos de todos los animales. Por lo tanto, es importante entender cómo y dónde la luz se atenúa y se dispersa dentro del tejido vivo. Sin embargo, a diferencia de los sistemas acuáticos, con tejido vivo, es imposible sumergir un instrumento en la columna de agua y obtener mediciones de luminosidad e irradiancia, y es necesaria una nueva técnica.
Otros métodos utilizados anteriormente para caracterizar las propiedades de absorción y dispersión del tejido vivo incluyen la medición de sondas de reflectancia tisular y / o esferas integradoras2,3, métodos microscópicos como la microscopía confocal de barrido 4, la medición de la difusión de la luz láser en la superficie5 y técnicasde modelado como la transferencia radiativa de Monte Carlo6. Los métodos experimentales mencionados a menudo requieren equipos específicos, grandes y costosos o conocimientos detallados sobre la estructura del tejido y generalmente están limitados en su capacidad para caracterizar la estructura espacial de la luz en las profundidades del tejido.
También existen métodos similares basados en sondas que utilizan una aguja hipodérmica para insertar una fibra óptica a través del tejido 7,8,9. En nuestra experiencia, las agujas modificadas son efectivas para perforar tejido, pero requieren una fuerza considerable y generalmente desgarran tejidos delicados cuando pasan a través de células densamente empaquetadas. Por lo tanto, estas agujas generalmente requieren un procedimiento quirúrgico para insertar más de un milímetro más o menos en una capa de tejido. El método descrito aquí, utilizando un soporte de vidrio lubricado y tirado, es capaz de deslizarse entre las células con una herida mínima del tejido y sin cirugía adicional.
Este manuscrito presenta un método inspirado en el trabajo de Jorgenson y sus colegas sobre la medición de la luz dentro de esteras de algas10,11, utilizando microsondas ópticas soportadas por vidrio y electrónica portátil que son susceptibles de sondear profundamente en el tejido denso y de la construcción y el uso en el campo. Estas sondas se pueden construir para caracterizar la irradiancia escalar (luz que golpea un punto desde todas las direcciones) y la radiación descendente (luz que interseca un plano horizontal) dentro del tejido vivo a altas resoluciones espaciales. Estas sondas fueron desarrolladas originalmente para medir la transferencia radiativa dentro del tejido de almejas gigantes fotosimbióticas12. Las mediciones estándar de absorción y transmisión del tejido total no fueron suficientes para caracterizar el rendimiento fotosintético del tejido, ya que hace una gran diferencia si toda la luz incidente es absorbida por unas pocas células que experimentan alta intensidad en la superficie del tejido o muchas células que experimentan bajas intensidades en todo el volumen del tejido. En un segundo proyecto, estas sondas se utilizaron para medir la irradiancia in vivo dentro del cerebro de un ratón13,14, caracterizando así el entorno de luz de las opsinas expresadas profundamente dentro del cerebro. Estas microsondas son lo suficientemente pequeñas y sensibles como para medir la irradiancia dentro del tejido cerebral del ratón con todo el pelaje, la piel y el hueso intactos y demostrar que los niveles de luz fisiológica son lo suficientemente altos como para estimular las opsinas cerebrales profundas.
Esta sonda microóptica y la configuración de medición podrían ser útiles para los investigadores que necesitan cuantificar y caracterizar la luz interna del tejido biológico, particularmente para una comprensión más matizada de la fotosíntesis o las funciones de los pigmentos visuales expresados fuera de los ojos. Este método se puede utilizar solo o junto con otras técnicas para caracterizar completamente las propiedades ópticas y la propagación de la luz dentro del tejido vivo a bajo costo, con pequeños equipos portátiles construidos internamente y con parámetros ajustables dependientes de la tarea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe una técnica para caracterizar sistemáticamente el entorno óptico a través de un gran volumen de tejido vivo con una resolución espacial aproximadamente en la escala de células individuales. Este método económico, flexible y manejable en campo podría ser útil para cualquier investigador que estudie la propagación de la luz dentro de los sistemas vivos. Por experiencia, en comparación con los métodos existentes7, estas sondas requieren un poco más de práctica y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Sanaz Vahidinia por presentarnos a los colegas del Dr. Jorgensen y su trabajo. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Oficina de Investigación del Ejército (no. W911NF-10-0139), la Oficina de Investigación Naval (a través del premio MURI no. N00014-09-1-1053) y el premio NSF-INSPIRE NSF-1343158.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
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