En mikrosond inom vävnadsradiometri för mätning av strålning in situ i levande vävnad
Summary
I denna uppsats beskrivs en metod för att mäta utstrålning in situ i levande vävnad. Detta arbete innehåller detaljer om konstruktion av mikroskaliga sonder för olika mätningar av strålning och irradians, ger vägledning för montering av vävnad för karakterisering av utstrålning och skisserar beräkningsmetoder för att analysera resulterande data.
Abstract
Organismer verkar ogenomskinliga till stor del på grund av att deras yttre vävnadsskikt sprider sig starkt till infallande ljus; Starkt absorberande pigment, såsom blod, har vanligtvis smala absorbanser, så att den genomsnittliga fria vägen för ljus utanför absorbanstopparna kan vara ganska lång. Eftersom människor inte kan se genom vävnad, föreställer de sig i allmänhet att vävnader som hjärnan, fett och ben innehåller lite eller inget ljus. Emellertid uttrycks fotoresponsiva opsinproteiner i många av dessa vävnader, och deras funktioner är dåligt förstådda. Utstrålning internt i vävnad är också viktigt för att förstå fotosyntes. Till exempel absorberar jättemusslor starkt men upprätthåller en tät population av alger djupt i vävnaden. Ljusutbredning genom system som sediment och biofilmer kan vara komplex, och dessa samhällen kan vara viktiga bidragsgivare till ekosystemets produktivitet. Därför har en metod för att konstruera optiska mikroprober för mätning av skalär irradians (fotonflöde som skär en punkt) och nedvällningsirradians (fotonflöde som passerar ett plan vinkelrätt) för att bättre förstå dessa fenomen inuti levande vävnad utvecklats. Denna teknik är också dragbar i fältlaboratorier. Dessa mikroprober är gjorda av värmedragna optiska fibrer som sedan säkras i dragna glaspipetter. För att ändra sondens vinkelacceptans säkras sedan en 10-100 μm stor sfär av UV-härdbar epoxi blandad med titandioxid till änden av en dragen, trimmad fiber. Sonden sätts in i levande vävnad, och dess position styrs med hjälp av en mikromanipulator. Dessa sonder kan mäta in situ-vävnadsstrålning vid rumsliga upplösningar på 10-100 μm eller på skalan av enskilda celler. Dessa sonder användes för att karakterisera ljuset som når fett- och hjärncellerna 4 mm under huden på en levande mus och för att karakterisera ljuset som når liknande djup i levande algrik jättemusselvävnad.
Introduction
Överraskande har landdjur och grunda havsboende tillräckligt med ljus i kroppen för visuell fysiologi och till och med fotosyntes. Till exempel dämpas ljusnivåerna i mitten av musens huvud (utanför de starka hemoglobinabsorbansbanden) med tre eller fyra storleksordningar i förhållande till omvärlden. Detta är ungefär skillnaden mellan ljusnivåerna inomhus och utomhus. Så, opaciteten hos en vävnad eller ett material på grund av stark spridning är inte detsamma som opacitet på grund av stark ljusabsorption. Ljus kan fortsätta att fortplanta sig över långa avstånd i ett starkt framåtriktat spridningssystem, liknande ljus som förökar sig genom akvatiska system med höga koncentrationer av celler och partiklar1. Denna observation är särskilt framträdande mot bakgrund av det faktum att opsinproteiner uttrycks nästan allestädes närvarande i alla vävnader hos alla djur. Därför är det viktigt att förstå hur och var ljuset dämpas och sprids i levande vävnad. Men till skillnad från akvatiska system, med levande vävnad, är det omöjligt att fördjupa ett instrument i vattenspelaren och få strålnings- och strålningsmätningar, och en ny teknik är nödvändig.
Andra metoder som tidigare använts för att karakterisera absorptions- och spridningsegenskaperna hos levande vävnad inkluderar mätning av vävnadsreflektanssonder och/eller integrering av sfärer2,3, mikroskopiska metoder såsom svepkonfokalmikroskopi4, mätning av diffusion av laserljus på ytan5 och modelleringstekniker såsom Monte Carlo strålningsöverföring6. De experimentella metoder som nämns kräver ofta specifik, stor och dyr utrustning eller detaljerad kunskap om vävnadsstruktur och är i allmänhet begränsade i sin förmåga att karakterisera den rumsliga strukturen av ljus djupt inne i vävnaden.
Det finns också liknande sondbaserade metoder som använder en hypodermisk nål för att sätta in en optisk fiber genom vävnad 7,8,9. Enligt vår erfarenhet är modifierade nålar effektiva vid punktering av vävnad men kräver avsevärd kraft och i allmänhet riva känsliga vävnader när de passerar genom tätt packade celler. Därför kräver dessa nålar i allmänhet ett kirurgiskt ingrepp för att sätta in mer än en millimeter eller så i ett vävnadsskikt. Metoden som beskrivs här, med användning av ett smurt, draget glasstöd, kan glida mellan celler med minimal sårning av vävnaden och utan ytterligare operation.
Detta manuskript presenterar en metod inspirerad av Jorgensons och kollegors arbete med att mäta ljus i algmattor10,11, med hjälp av glasstödda optiska mikrosonder och bärbar elektronik som är mottagliga för att undersöka djupt in i tät vävnad och för konstruktion och användning i fält. Dessa sonder kan konstrueras för att karakterisera skalär irradians (ljus som träffar en punkt från alla håll) och nedvällande strålning (ljus som skär ett horisontellt plan) inuti levande vävnad vid höga rumsliga upplösningar. Dessa sonder utvecklades ursprungligen för att mäta strålningsöverföring i vävnaden hos fotosymbiotiska jättemusslor12. Standardmätningar av absorption och överföring av den totala vävnaden var inte tillräckliga för att karakterisera vävnadens fotosyntetiska prestanda, eftersom det gör stor skillnad om allt infallande ljus absorberas av några celler som upplever hög intensitet vid vävnadens yta eller många celler som upplever låga intensiteter i hela vävnadens volym. I ett andra projekt användes dessa sonder för att mäta in vivo-instrålning i en mus hjärna13,14 och karakteriserade därmed ljusmiljön för opsiner som uttrycks djupt inne i hjärnan. Dessa mikrosonder är både små och känsliga nog för att mäta instrålning i mushjärnvävnad med all päls, hud och ben intakt och visa att fysiologiska ljusnivåer lätt är tillräckligt höga för att stimulera djupa hjärnopsiner.
Denna mikrooptiska sond och mätinställning kan vara användbar för forskare som behöver kvantifiera och karakterisera ljuset inuti biologisk vävnad, särskilt för en mer nyanserad förståelse av fotosyntes eller funktionerna hos visuella pigment som uttrycks utanför ögonen. Denna metod kan användas ensam eller tillsammans med andra tekniker för att fullt ut karakterisera de optiska egenskaperna och ljusutbredningen i levande vävnad till en låg kostnad, med liten bärbar utrustning inbyggd internt och med uppgiftsberoende justerbara parametrar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en teknik för att systematiskt karakterisera den optiska miljön genom en stor volym levande vävnad med en rumslig upplösning ungefär på skalan av enskilda celler. Denna billiga, flexibla och fältdragbara metod kan vara användbar för alla forskare som studerar ljusets utbredning inom levande system. Av erfarenhet, jämfört med befintliga metoder7, kräver dessa sonder lite mer övning och skicklighet att bygga men resulterar i mindre vävnadsskador och förmågan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Sanaz Vahidinia för att introducera oss till Dr. Jørgensens kollegor och hans arbete. Denna forskning stöddes av bidrag från Army Research Office (nr. W911NF-10-0139), Office of Naval Research (genom MURI award no. N00014-09-1-1053) och NSF-INSPIRE award NSF-1343158.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393 (2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309 (2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316 (2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678 (2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
