Bestemmelse af haploider parringseffektivitet i Saccharomyces cerevisiae

Summary

I dette arbejde beskrives en robust metode til kvantificering af parringseffektivitet i gæren Saccharomyces cerevisiae . Denne metode er især nyttig til kvantificering af præzygotiske barrierer i specieringsundersøgelser.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae er en meget anvendt modelorganisme inden for genetik, evolution og molekylærbiologi. I de senere år er det også blevet en populær modelorganisme at studere problemer relateret til speciering. Gærens livscyklus involverer både aseksuelle og seksuelle reproduktive faser. Den lette udførelse af evolutionseksperimenter og organismens korte generationstid giver mulighed for undersøgelse af udviklingen af reproduktive barrierer. Den effektivitet, hvormed de to parringstyper (a og α) parrer sig for at danne a/α-diploide, kaldes parringseffektiviteten. Ethvert fald i parringseffektiviteten mellem haploider indikerer en præ-zygotisk barriere. For at kvantificere omfanget af reproduktiv isolation mellem to haploider kræves der således en robust metode til at kvantificere parringseffektiviteten. Til dette formål præsenteres en enkel og meget reproducerbar protokol her. Protokollen involverer fire hovedtrin, som inkluderer lapning af haploider på en YPD-plade, blanding af haploider i lige store mængder, fortynding og plettering for enkeltkolonier og endelig beregning af effektiviteten baseret på antallet af kolonier på en drop-out plade. Auxotrofiske markører anvendes til klart at skelne mellem haploider og diploider.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, almindeligvis kaldet spirende gær, er en encellet eukaryot. Den har to parringstyper, a og α, og udviser både aseksuelle og seksuelle reproduktive cyklusser. A- og α parringstyperne er haploider og kan dele sig mitotisk i fravær af den anden parringstype i det omgivende miljø, som repræsenterer gærens aseksuelle cyklus. Når de to parringstyper er tæt på hinanden, holder de op med at dele sig mitotisk og smelter sammen for at danne en diploid celle. Den diploide gær kan enten opdele mitotisk, når næringsstoffer er til stede eller gennemgå meiose under betingelserne for kvælstofsult i nærværelse af en dårlig kulstofkilde, der ikke kan fermenteres, såsom acetat¹. Dette resulterer i dannelsen af sporer, som forbliver sovende, indtil der er gunstige vækstbetingelser. Livscyklussen er afsluttet, når disse sporer spirer, og de to haploide typer frigives tilbage til den haploide pulje ^2,3 (figur 1).

Parring af gærceller indbefatter flere trin, såsom agglutination, dannelse af en parringsprojektion eller “shmoo” efterfulgt af celle- og nuklear fusion ^4,5. De to parringstyper a og α producerer henholdsvis a-faktor og α-faktor for at indlede parring. Disse faktorer er polypeptidferomoner, der binder til receptorerne (Ste2 og Ste3), der er til stede på celleoverfladen af den modsatte parringstype⁵. Bindingen af feromonerne til receptorerne initierer feromonresponsvejen, den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) signaltransduktionsvej ^6,7,8. Dette resulterer i anholdelse af cellecyklussen i G1-fasen, hvilket fører til en metabolisk aktiv stationær fase⁹. Cellerne holder derefter op med at dele sig mitotisk, og de proteiner, der kræves til parring, syntetiseres. Da de haploide celler ikke kan bevæge sig mod hinanden, er en parringsprojektion eller “shmoo” rettet mod parringspartneren. Når cellerne kommer i kontakt, nedbrydes cellevæggen, og det cytoplasmatiske indhold smelter sammen, hvilket resulterer i parring til dannelse af en diploid celle^10,11. Parringseffektiviteten mellem haploider er blevet brugt som et mål for speciering i laboratorieudviklede stammer såvel som mellem eksisterende arter¹².

At være en simpel eukaryot organisme er gær den valgte model for et stort antal forskningsspørgsmål forbundet med komplekse eukaryote organismer. Et sådant spørgsmål er forbundet med speciering og udviklingen af reproduktive barrierer^13,14. For seksuelt reproducerende organismer defineres en art af det biologiske artskoncept (BSC) foreslået af Ernst Mayr¹⁵. Ifølge dette koncept siges to individer i en befolkning at tilhøre to forskellige arter, hvis de ikke kan krydse hinanden og er reproduktivt isoleret. Nedbrydning af den seksuelle reproduktive cyklus (som involverer fusion af kønsceller til dannelse af en zygote, udviklingen af zygoten til et afkom og opnåelse af seksuel modenhed hos afkommet) fører til reproduktiv isolation. Som vist i figur 1 er livscyklussen for S. cerevisiae sammenlignelig med den seksuelle reproduktionscyklus: a) fusionen af de to parringstyper a og α svarer til fusionen af kønsceller i seksuelt reproducerende organismer; b) diploidens evne til at gennemgå mitotisk opdeling svarer til, at zygoten udvikler sig til afkom; og c) den diploide, der gennemgår sporulation, er sammenlignelig med processen med gametogenese¹⁴.

Pre-zygotisk isolering opstår, når assortativ parring observeres. Givet lige mulighed for at parre sig med to genetisk forskellige a-typer , parrer en α type fortrinsvis med den ene frem for den anden eller omvendt¹⁴. I tilfælde af evolutionseksperimenter, hvor haploider er blevet udviklet i forskellige miljøer, kan tilstedeværelsen af en præparringsbarriere bestemmes ved at udføre et parringsassay. Et fald i parringseffektiviteten sammenlignet med forfaderen indikerer udviklingen af en præparringsbarriere. Postzygotisk isolation kan opstå på grund af diploidens manglende evne til at gennemgå effektiv mitotisk deling og/eller sporulation til dannelse af haploide sporer¹⁴. Disse kan kvantificeres ved at måle henholdsvis diploidernes væksthastighed og beregne sporulationseffektiviteten. For at studere udviklingen af reproduktive barrierer kræves der derfor robuste metoder til kvantificering af (a) parringseffektiviteten, (b) den mitotiske vækst af diploiden og (c) diploidens sporulationseffektivitet. I dette arbejde rapporteres en robust metode til at kvantificere gærstammernes parringseffektivitet.

I laboratorieforsøg er en af måderne, hvorpå forekomsten af parring kan detekteres, ved hjælp af auxotrofe markører, der supplerer ernæringskravene. Når de to parringstyper er auxotrofe for to forskellige aminosyrer, kan kun den diploide celle dannet ved fusion af de to parringstyper vokse på et medium, der mangler begge aminosyrer. Således er auxotrofe markører nyttige til påvisning af parring både kvalitativt og kvantitativt. En kvalitativ test vil være tilstrækkelig til at identificere parringstypen af en stamme efter meiose¹⁶. Kvantitative tests er afgørende, når man er interesseret i at identificere en reduktion i parring, mens man studerer de gener, der er involveret i parringsvejen^17,18. Da gær i stigende grad anvendes i specieringsundersøgelser, er det desuden nødvendigt med et praktisk og reproducerbart parringsassay, da kvantificeringen af parringseffektiviteten er et mål for den præzygotiske barriere.

Parringseffektiviteten mellem de to gærparringstyper er tidligere blevet kvantificeret^16,19,20. De fleste af de tidligere anvendte metoder er ens i deres design med nogle få variationer 16,21,22,23,24,25. Nogle af dem bruger tidlige logfasekulturer, mens nogle få andre bruger mid-log fasekulturer af haploide stammer. Der er variationer i forholdene, hvor de to parringstyper blandes. Næsten alle protokollerne bruger en nitrocellulosemembran. Suspensioner af begge parringstyper taget fra tidligere dyrkede kulturer blandes og filtreres på en nitrocellulosemembran anbragt på en YPD-plade. I en af variationerne af protokollen lappes den haploide suspension direkte på en YPD-plade²¹. I forsøg, der beskæftiger sig med de gener, der er involveret i feromonproduktionen af de to parringstyper, tilsættes feromonerne eksternt, mens suspensionerne af de to parringstyper^{fremstilles 24}.

Efter inkubation i et par timer (typisk ca. 5 timer) efter blanding af haploider vaskes cellerne fra membranen, fortyndes og belægges på selektive medier. I en af de tidligere metoder, der blev rapporteret i 1973, blev effektiviteten af zygotdannelse eller parring beregnet ved at tælle antallet af spirende celler, unbudded celler og parringspar under et mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer²⁶. Imidlertid bruger de fleste metoder, der rapporteres senere, auxotrofiske markører til at skelne haploider og diploider. Parringseffektivitet beregnes som procentdelen af diploide celler i forhold til antallet af diploide og haploide celler i den cellulære pulje 16,21,23.

På trods af en række rapporter, der bruger gær som modelorganisme til at studere speciering, er der imidlertid ingen standardiseret protokol rapporteret i litteraturen indtil nu til beregning af effektiviteten af parring. Celler i logfasen er muligvis ikke ideelle til kvantificering af parringseffektivitet. Under parring arresteres cellecyklussen for de to haploider, og cellerne under parring deler sig derfor ikke⁹. Da cellecyklussen også vides at være arresteret på samme måde i celler i den stationære fase²⁷, kan brug af sådanne celler gøre protokollen mere reproducerbar. Stationære faseceller kan blandes og lægges på YPD-plader (dvs. et ernæringsrigt miljø) til parring. De konventionelle procedurer kræver også en nitrocellulosemembran og vask af cellerne, hvilket gør processen besværlig og udsat for håndteringsfejl. Derudover kvantificerer de hidtil anvendte protokoller parringseffektiviteten i form af en haploid. Ved måling af reproduktiv isolation kvantificeres parringseffektiviteten imidlertid for en bestemt kombination af haploider snarere end en enkelt haploide.

For at løse disse problemer rapporterer vi her en robust metode til kvantificering af parringseffektivitet i gær, der er meget reproducerbar og nem at bruge. Desuden kan denne metode og de gærstammer, der anvendes her, også bruges i undersøgelser, der undersøger effekten af genflow på udviklingen af parringsbarrierer.

To forskellige stammer af S. cerevisiae blev anvendt i denne undersøgelse. En af stammerne stammer fra SK1-baggrunden; dette blev ændret i vores laboratorium ved at tilføje de auxotrofiske markører nær MAT-locus. De resulterende genotyper af haploider er angivet i tabel 1^28,29,30. I SK1-stammen havde a-haploiden TRP1-genet indsat nær MAT-locus, og den α haploid havde LEU2-genet indsat nær MAT-locus. I ScAM-stammen blev TRP1– og URA3-generne indsat i henholdsvis a- og α-haploider. Placeringen af indsættelsen var i ARS-regionen af kromosom III (Chr III: 197378..197609). For den protokol, der er rapporteret her, ville auxotrofe markører overalt på genomet være tilstrækkelige. At have de auxotrofe markører nær MAT-locus betyder imidlertid, at disse stammer også kan bruges til undersøgelser, der undersøger effekten af genflow på speciering^31,32. Markørerne blev tilføjet tæt på MAT-locus for at forhindre omrokering af markørerne på grund af rekombination. Derfor kan denne protokol bruges til at kvantificere parringseffektivitet i undersøgelser, der involverer speciering, og også til at identificere ændringen af parringseffektivitet, når man studerer proteinerne involveret i parringsvejen.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen involverer stort set følgende trin: (1) lapning af haploider i parringseffektivitetsgitterene på en YPD-plade, (2) blanding af haploider i lige stort antal efter 24 timers inkubation og give de blandede haploider et par timer til at parre sig (7 timer i denne undersøgelse), (3) plettering af de blandede celler på YPD til isolering af enkeltkolonier efter 7 timer ved 30 °C, og endelig (4) bestemmelse af antallet af diploider dannet ved anvendelse af de auxotrofe markører. Disse trin diskuteres …

Representative Results

Kvantificering af parringseffektiviteten af de to parringstyperProtokollen beskrevet her blev brugt til at kvantificere parringseffektiviteten mellem to gærstammer – mellem SK1AM a og SK1AM α og mellem ScAMa og ScAMα (figur 3A). I disse eksperimenter blev parringen mellem de to haploider gentaget mindst 12 gange. I hver af gentagelserne af eksperimentet blev mindst 100 kolonier stribet på dobbelt dr…

Discussion

Kvantificeringen af parringseffektiviteten i S. cerevisiae er afgørende for at udføre undersøgelser relateret til de gener, der er involveret i parringsveje eller studere det ydre miljøs indflydelse på parringsadfærd. I de sidste to årtier er S. cerevisiae også blevet en populær model til at løse spørgsmål relateret til speciering 14,36,37,38. Tilstedeværelsen af …

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520