Anrikning av vuxna musdorsala rotganglier neuronkulturer genom immunpanorering
Summary
Detta dokument beskriver ett immunpanoreringsprotokoll för vuxna musdorsala rotganglier. Genom att fästa antikroppar mot odlingsplattor kan vi negativt välja och ta bort icke-neuronala celler. Vi visar att kulturerna är berikade för neuroner med hjälp av detta protokoll, vilket möjliggör en djupgående studie av neuronala svar på manipulation.
Abstract
Dorsalrotganglierna (DRG) är perifera strukturer intill ryggmärgens dorsala horn, som rymmer cellkropparna hos sensoriska neuroner såväl som olika andra celltyper. Publicerade odlingsprotokoll hänvisar ofta till hela dissocierade DRG-kulturer som neuronala, trots närvaron av fibroblaster, Schwann-celler, makrofager och lymfocyter. Medan dessa hela DRG-kulturer är tillräckliga för avbildningsapplikationer där neuroner kan urskiljas baserat på morfologi eller färgning, är protein- eller RNA-homogenat som samlats in från dessa kulturer inte primärt neuronala ursprung. Här beskriver vi en immunpanoreringssekvens för odlade mus-DRG. Målet med denna metod är att berika DRG-kulturer för neuroner genom att ta bort andra celltyper. Immunopanering avser en metod för att avlägsna celltyper genom att vidhäfta antikroppar mot cellodlingsrätter. Med hjälp av dessa rätter kan vi negativt välja mot och minska antalet fibroblaster, immunceller och Schwann-celler i odling. Denna metod tillåter oss att öka andelen neuroner i kulturer.
Introduction
Dorsalrotganglierna (DRG) rymmer cellkropparna i de sensoriska neuronerna som innerverar perifera vävnader. Genom att studera dessa neuroner kan vi förstå den mekanistiska grunden för smärta och sensoriska tillstånd. DRG består emellertid inte av neuroner ensamma, utan innehåller också fibroblaster, Schwann-celler, makrofager och andra immunceller1. Trots närvaron av dessa olika celltyper kallas hela DRG-kulturer ofta i litteraturen som neuronala 2,3. Dessa kulturer är fortfarande användbara för neuronal undersökning genom avbildning eller flödescytometri, vilket skulle möjliggöra neuronal identifiering genom färgning, cellstorlek och / eller morfologi. För analyser såsom polymeraskedjereaktion (PCR) eller western blotting, där kulturer homogeniseras för RNA- eller proteinuppsamling, kan närvaron av icke-neuronala celltyper störa resultaten. Därför finns det ett behov av att öka andelen neuronala celler i DRG-kulturer.
Immunopanering är en teknik som används för att rena en mängd olika celltyper, inklusive kortikala neuroner, astrocyter, oligodendrocytprekursorceller och mikroglia. Enkelt uttryckt innebär det att en antikropp vidhäftas mot en cellytemarkör till en petriskål, avsedd att binda vissa celler (figur 1), och den kan användas för att välja antingen för eller mot celltyper av intresse 4,5,6. Immunpanorering av embryonala DRG hos råtta för att selektera mot icke-neuronala celler har tidigare beskrivits av Zuchero7. Vi har dock inte kunnat hitta ett immunopanoreringsprotokoll specifikt för DRG hos möss. I detta protokoll bygger vi vidare på de grundläggande klienterna i Zuchero-protokollet, men anpassade istället immunopanoreringssekvensen för att berika vuxna DRG-kulturer hos möss (figur 2). Detta är ett kraftfullt verktyg för att studera etablerade sensoriska neuroner i kultur. Det är fördelaktigt eftersom det möjliggör användning av vuxna möss från genetiska, sjukdoms- och skademodeller, så att deras sensoriska neuroner kan studeras med större specificitet.
Detta protokoll är fördelaktigt för läsare som vill öka andelen neuroner i vuxna mus DRG-kulturer. Emellertid kan immunpanoreringsstegen också utelämnas, och detta protokoll kan också användas för hela DRG-kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta immunpanoreringsprotokoll ökar andelen neuronala celler i DRG-primärkulturer. För bästa resultat bör dissektioner göras i tid, och DRG bör trimmas av överflödiga nerver. Dissociationssteget bör övervakas noggrant och bör inte överstiga 1 h för att förhindra att cellerna utsätts för onödig stress. När det gäller immunpanorering specifikt bör varje platta försiktigt snurras halvvägs för att cellerna ska få tillgång till de belagda antikropparna. Plattorna bör också ses under ett odlingsmik…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett projektbidrag från Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) och ett Discovery Grant från MS Society of Canada (EGID-3761). Författarna vill tacka Dr. Sun och Cross Cancer Institute för utbildning och användning av ImageXpress-systemet.
Materials
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Biologie du développement. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
