Anvendelse af flowvermimetri til kvantificering og analyse af Caenorhabditis elegans tarmmikrobiomet
Summary
Caenorhabditis elegans er en kraftfuld model til at undersøge de molekylære determinanter, der driver værtsmikrobiominteraktioner. Vi præsenterer en pipeline med høj kapacitet, der profilerer de enkelte dyrs niveauer af tarmmikrobiomkolonisering sammen med nøgleaspekter af C. elegans fysiologi.
Abstract
Sammensætningen af tarmmikrobiomet kan have en dramatisk indvirkning på værtsfysiologien gennem dyrets udvikling og liv. Måling af sammensætningsændringer i mikrobiomet er afgørende for at identificere de funktionelle forhold mellem disse fysiologiske ændringer. Caenorhabditis elegans er opstået som et kraftfuldt værtssystem til at undersøge de molekylære drivkræfter for værtsmikrobiominteraktioner. Med sin gennemsigtige kropsplan og fluorescerende mærkede naturlige mikrober kan de relative niveauer af mikrober i tarmmikrobiomet hos et individuelt C. elegans-dyr let kvantificeres ved hjælp af en stor partikelsorterer. Her beskriver vi procedurerne for eksperimentel opsætning af et mikrobiom, indsamling og analyse af C. elegans populationer i det ønskede livsstadium, drift og vedligeholdelse af sortereren og statistiske analyser af de resulterende datasæt. Vi diskuterer også overvejelser om optimering af sorteringsindstillinger baseret på mikrober af interesse, udvikling af effektive gatingstrategier for C. elegans livsstadier, og hvordan man udnytter sorteringskapacitet til at berige dyrepopulationer baseret på tarmmikrobiomsammensætning. Eksempler på potentielle applikationer vil blive præsenteret som en del af protokollen, herunder potentialet for skalerbarhed til applikationer med højt gennemløb.
Introduction
Dyrenes evolution er under konstant mikrobiel indflydelse1. Fra forskellige mikrober i miljøet erhverver dyreværter specifikke partnere2 , der udvider værtsens evner og driver dets fysiologi og modtagelighed for sygdom3. For eksempel afdækkede metagenomiske analyser af tarmmikrobiomet berigede metaboliske klasser af mikrobielle gener, der kan give større energihøst og lagring i overvægtige mus4, hvoraf mange også findes i det menneskelige tarmmikrobiom5. Der er stadig et stort behov for at etablere årsagssammenhænge og lokalisere de molekylære determinanter for mikrobiompåvirkningen, selvom fremskridt er blevet hæmmet af værtssystemernes mikrobiomkompleksitet og trækbarhed til storskala screening.
Modelorganismen C. elegans giver en platform til at fremme molekylær forståelse af forbindelser mellem mikrobiom og værtsfysiologi. C. elegans besidder 20 tarmceller med et slimhindelaget og villistrukturer. Disse celler er udstyret med rigelige kemoreceptorgener, der fornemmer mikrobielle produkter og producerer antimikrobielle molekyler, der potentielt regulerer deres tarmkolonisatorer 6,7. Denne bevarede biologi af C. elegans har ført til et enormt antal opdagelser i værtssignalering, der regulerer tarmmikrober, herunder insulinsignalering, TGF-beta og MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans bruger mikrober som både deres kost til vækst under udvikling og mikrobiom som voksne. Med alderdom kan nogle mikrober overakkumulere i tarmens lumen, og værtsmikrobeforholdet skifter fra symbiose til patogenese11. I deres naturlige levesteder møder C. elegans en bred vifte af bakteriearter12,13. Sekventering af 16S rDNA fra repræsentative prøver indsamlet i naturlige levesteder (rådne frugter, plantestamme og dyrevektorer) afslørede, at det naturlige mikrobiom af C. elegans domineres af fire bakterielle phyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria. Inden for disse opdelinger ligger stor variation i mangfoldigheden og rigdommen af bakterier baseret på habitatet12,13,14,15. Flere definerede samfund er blevet etableret, herunder samlingerne med 63 medlemmer (BIGbiome)16 og 12 medlemmer (CeMbio), der repræsenterer de øverste mikrobiomslægter, der er skabt til C. elegans-forskningssamfundet 17. Både mikrobiomer og komponentstammer kan have en forskellig indvirkning på fysiologien hos C. elegans, såsom kropsstørrelse, vækstrater og stressresponser 9,16,17. Disse undersøgelser giver ressourcer og eksempler til at etablere C. elegans som en model for mikrobiomforskning.
Her præsenteres en stor partikelsorteringsbaseret arbejdsgang (LPS) (figur 1), der udnytter C. elegans-systemet til samtidig at måle mikrobiomsammensætning og grundlæggende mål for værtsfysiologi på populationsskala. Fra den mikrobielle side kan arbejdsgangen tilpasses til at samle et defineret mikrobiom eller enkelte mikrober for at teste samfundets robusthed og plasticitet med stigende mikrobielle interaktioner. Fra værtssiden muliggør arbejdsgangen analyser med høj gennemstrømning for at måle koloniseringsniveauer af fluorescerende mikrober i mikrobiomet og være vært for fysiologisk aflæsning med hensyn til udvikling, kropsstørrelse og reproduktion. Samlet set muliggør C. elegans-mikrobiommodellen skærme med høj gennemstrømning for at lokalisere de metaboliske og genetiske determinanter, der modulerer værtsfysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flowvermimetri er blevet brugt til at karakterisere C. elegans gener og veje mod patogenkolonisering og toksicitet i flere undersøgelser21,22. Her præsenteres en høj gennemstrømningsmetode, der bruger C. elegans til at undersøge, hvordan tarmmikrobiomer modulerer deres værtsfysiologi. Sammenlignet med eksisterende metoder, der anvender kolonidannende enheder (CFU) eller 16S rRNA-ampliconsekventering 9,16,17,23,24<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud DP2DK116645 (til BSS), Dunn Foundation pilotpris og NASA-tilskud 80NSSC22K0250 (til BSS). Dette projekt blev også støttet af cytometri og cellesorteringskerne ved Baylor College of Medicine med finansiering fra CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 og RR024574) og bistand fra Joel M. Sederstrom plus et instrumenteringstilskud til LPS NIH-tilskuddet (S10 OD025251). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. . tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Génétique. 207 (2), 447-463 (2017).
