Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.
Abstract
La composition du microbiome intestinal peut avoir un impact considérable sur la physiologie de l’hôte tout au long du développement et de la vie de l’animal. La mesure des changements de composition dans le microbiome est cruciale pour identifier les relations fonctionnelles entre ces changements physiologiques. Caenorhabditis elegans est apparu comme un puissant système hôte pour examiner les moteurs moléculaires des interactions hôte-microbiome. Grâce à son plan corporel transparent et à ses microbes naturels marqués par fluorescence, les niveaux relatifs de microbes dans le microbiome intestinal d’un animal C. elegans individuel peuvent être facilement quantifiés à l’aide d’un grand trieur de particules. Nous décrivons ici les procédures de mise en place expérimentale d’un microbiome, la collecte et l’analyse des populations de C. elegans au stade de vie souhaité, le fonctionnement et la maintenance du trieur, ainsi que les analyses statistiques des ensembles de données résultants. Nous discutons également des considérations relatives à l’optimisation des paramètres du trieur en fonction des microbes d’intérêt, du développement de stratégies de contrôle efficaces pour les stades de vie de C. elegans et de la façon d’utiliser les capacités du trieur pour enrichir les populations animales en fonction de la composition du microbiome intestinal. Des exemples d’applications potentielles seront présentés dans le cadre du protocole, y compris le potentiel d’évolutivité vers des applications à haut débit.
Introduction
L’évolution animale est sous l’influence microbienne constante1. À partir de divers microbes présents dans l’environnement, les hôtes animaux acquièrent des partenaires spécifiques2 qui étendent les capacités de l’hôte et déterminent sa physiologie et sa susceptibilité aux maladies3. Par exemple, les analyses métagénomiques du microbiome intestinal ont révélé des classes métaboliques enrichies de gènes microbiens qui peuvent conférer une plus grande récolte et stockage d’énergie chez les souris obèses4, dont beaucoup se trouvent également dans le microbiome intestinal humain5. Il y a encore un grand besoin d’établir des relations causales et d’identifier les déterminants moléculaires de l’impact du microbiome, bien que les progrès aient été entravés par la complexité du microbiome et la traçabilité des systèmes hôtes au criblage à grande échelle.
L’organisme modèle C. elegans fournit une plate-forme pour faire progresser la compréhension moléculaire des liens entre le microbiome et la physiologie de l’hôte. C. elegans possède 20 cellules intestinales avec une couche muqueuse et des structures de villosités. Ces cellules sont dotées d’abondants gènes chimiorécepteurs qui détectent les produits microbiens et produisent des molécules antimicrobiennes qui régulent potentiellement leurs colonisateurs intestinaux 6,7. Cette biologie conservée de C. elegans a conduit à un grand nombre de découvertes dans la signalisation de l’hôte qui régule les microbes intestinaux, y compris la signalisation de l’insuline, le TGF-bêta et la MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans utilise les microbes à la fois comme régime alimentaire pour la croissance pendant le développement et comme microbiome à l’âge adulte. Avec l’âge, certains microbes peuvent s’accumuler trop dans la lumière intestinale et la relation hôte-microbe passe de la symbiose à la pathogenèse11. Dans son habitat naturel, C. elegans rencontre un large éventail d’espèces bactériennes12,13. Le séquençage de l’ADNr 16S à partir d’échantillons représentatifs prélevés dans des habitats naturels (fruits pourris, tiges végétales et vecteurs animaux) a révélé que le microbiome naturel de C. elegans est dominé par quatre phylums bactériens : les protéobactéries, les Bacteroidetes, les Firmicutes et les Actinobactéries. À l’intérieur de ces divisions, il y a une grande variation dans la diversité et la richesse des bactéries en fonction de l’habitat12,13,14,15. Plusieurs communautés définies ont été établies, y compris les collections de 63 membres (BIGbiome)16 et de 12 membres (CeMbio) représentant les principaux genres de microbiome créés pour la communauté de recherche de C. elegans 17. Les microbiomes et les souches constitutives peuvent avoir un impact diversifié sur la physiologie de C. elegans, comme la taille corporelle, les taux de croissance et les réponses au stress 9,16,17. Ces études fournissent des ressources et des exemples pour établir C. elegans comme modèle pour la recherche sur le microbiome.
Ici, un flux de travail basé sur un grand trieur de particules (LPS) (Figure 1) est présenté qui utilise le système C. elegans pour mesurer simultanément la composition du microbiome et les mesures de base de la physiologie de l’hôte à l’échelle de la population. Du côté microbien, le flux de travail est adaptable pour assembler un microbiome défini ou des microbes uniques afin de tester la robustesse et la plasticité de la communauté avec des interactions microbiennes croissantes. Du côté de l’hôte, le flux de travail permet des tests à haut débit pour mesurer les niveaux de colonisation des microbes fluorescents dans le microbiome et la lecture physiologique de l’hôte en termes de développement, de taille corporelle et de reproduction. Dans l’ensemble, le modèle de microbiome de C. elegans permet à des criblages à haut débit d’identifier les déterminants métaboliques et génétiques modulant la physiologie de l’hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vermimétrie en flux a été utilisée pour caractériser les gènes et les voies de C. elegans contre la colonisation et la toxicité des agents pathogènes dans plusieurs études21,22. Ici, une approche à haut débit est présentée qui utilise C. elegans pour étudier comment les microbiomes intestinaux modulent la physiologie de leur hôte. Par rapport aux méthodes existantes utilisant des unités formant colonie (UFC) ou le séquençag…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH DP2DK116645 (à B.S.S.), une bourse pilote de la Fondation Dunn et une subvention de la NASA 80NSSC22K0250 (à B.S.S.). Ce projet a également été soutenu par le centre de cytométrie et de tri cellulaire du Baylor College of Medicine avec un financement de la bourse de soutien aux installations de base du CPRIT (CPRIT-RP180672), du NIH (S10 OD025251, CA125123 et RR024574) et de l’aide de Joel M. Sederstrom, ainsi que d’une subvention d’instrumentation pour la subvention LPS NIH (S10 OD025251). Certaines souches ont été fournies par le CCG, qui est financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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