יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.
Abstract
להרכב מיקרוביום המעי יכולה להיות השפעה דרמטית על הפיזיולוגיה של המאכסן לאורך ההתפתחות והחיים של החיה. מדידת השינויים בהרכב המיקרוביום חיונית לזיהוי הקשרים התפקודיים בין השינויים הפיזיולוגיים הללו. Caenorhabditis elegans התפתחה כמערכת מארחת רבת עוצמה לבחינת המניעים המולקולריים של אינטראקציות מיקרוביום מארח. בעזרת תוכנית הגוף השקופה שלו והמיקרובים הטבעיים המתויגים כפלואורסצנטיים, ניתן לכמת בקלות את הרמות היחסיות של מיקרובים בתוך מיקרוביום המעי של בעל חיים בודד מסוג C. elegans באמצעות ממיין חלקיקים גדול. כאן אנו מתארים את ההליכים להקמה ניסיונית של מיקרוביום, איסוף וניתוח של אוכלוסיות C. elegans בשלב החיים הרצוי, תפעול ותחזוקת המיון, וניתוחים סטטיסטיים של מערכי הנתונים המתקבלים. כמו כן, נדון בשיקולים לאופטימיזציה של הגדרות המיון בהתבסס על המיקרובים המעניינים, בפיתוח אסטרטגיות גטינג יעילות לשלבי החיים של C. elegans , וכיצד לנצל את יכולות המיון להעשרת אוכלוסיות בעלי חיים בהתבסס על הרכב מיקרוביום המעי. דוגמאות ליישומים פוטנציאליים יוצגו כחלק מהפרוטוקול, כולל פוטנציאל למדרגיות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה.
Introduction
אבולוציה של בעלי חיים נמצאת תחת השפעה מיקרוביאלית מתמדת1. ממיקרובים מגוונים בסביבה, פונדקאים של בעלי חיים רוכשים שותפים ספציפיים2 המרחיבים את יכולותיו של הפונדקאי ומניעים את הפיזיולוגיה והרגישות שלו למחלות3. לדוגמה, ניתוחים מטאגנומיים של מיקרוביום המעי חשפו סוגים מטבוליים מועשרים של גנים מיקרוביאליים שעשויים להעניק קצירת אנרגיה גדולה יותר ואחסון בעכברים שמנים4, שרבים מהם נמצאים גם במיקרוביום המעי האנושי5. עדיין יש צורך גדול לבסס קשרים סיבתיים ולאתר את הגורמים המולקולריים של השפעת המיקרוביום, אם כי ההתקדמות עוכבה על ידי מורכבות המיקרוביום והיכולת של מערכות מארחות לבצע בדיקות סקר בקנה מידה גדול.
אורגניזם המודל C. elegans מספק פלטפורמה לקידום הבנה מולקולרית של הקשרים בין מיקרוביום ופיזיולוגיה של המאכסן. C. elegans בעל 20 תאי מעיים עם שכבה רירית ומבנים villi. תאים אלה מצוידים בשפע גנים כימורצפטורים החשים תוצרים מיקרוביאליים ומייצרים מולקולות אנטי-מיקרוביאליות שעשויות לווסת את מושבות המעיים שלהם 6,7. הביולוגיה השמורה הזו של C. elegans הובילה למספר עצום של תגליות באיתות מארח המווסתות את חיידקי המעי, כולל איתות אינסולין, TGF-beta ו-MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans משתמשים במיקרובים הן כתזונה לגדילה במהלך ההתפתחות והן כמיקרוביום כמבוגרים. עם הזקנה, חלק מהחיידקים עלולים להצטבר יתר על המידה בלומן המעי והקשר בין הפונדקאי למיקרוב עובר מסימביוזה לפתוגנזה11. בבתי הגידול הטבעיים שלהם, C. elegans פוגש מגוון רחב של מיני חיידקים12,13. ריצוף rDNA 16S מדגימות מייצגות שנאספו בבתי גידול טבעיים (פירות רקובים, גזע צמח ווקטורים של בעלי חיים) גילה כי המיקרוביום הטבעי של C. elegans נשלט על ידי ארבעה פילות חיידקים: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, ו Actinobacteria. בתוך חלוקות אלה טמונה שונות רבה במגוון ובעושר של חיידקים המבוססים על בית הגידול12,13,14,15. מספר קהילות מוגדרות הוקמו, כולל אוספי 63 חברים (BIGbiome)16 ו-12 חברים (CeMbio) המייצגים את סוגי המיקרוביום המובילים שנוצרו עבור קהילת המחקר C. elegans 17. גם למיקרוביום וגם לזני רכיבים יכולה להיות השפעה מגוונת על הפיזיולוגיה של C. elegans, כמו גודל הגוף, קצב הגדילה ותגובות סטרס 9,16,17. מחקרים אלה מספקים משאבים ודוגמאות לביסוס C. elegans כמודל לחקר המיקרוביום.
כאן מוצג תהליך עבודה מבוסס ממיין חלקיקים גדול (LPS) (איור 1) המשתמש במערכת C. elegans כדי למדוד בו-זמנית את הרכב המיקרוביום ואת המדדים הבסיסיים של הפיזיולוגיה של המאכסן בקנה מידה של האוכלוסייה. מהצד המיקרוביאלי, זרימת העבודה ניתנת להתאמה כדי להרכיב מיקרוביום מוגדר או מיקרואורגניזמים בודדים כדי לבחון את החוסן והפלסטיות של הקהילה עם אינטראקציות מיקרוביאליות הולכות וגדלות. מהצד המארח, זרימת העבודה מאפשרת מבחני תפוקה גבוהה למדידת רמות הקולוניזציה של מיקרובים פלואורסצנטיים במיקרוביום וקריאה פיזיולוגית של המארח במונחים של התפתחות, גודל גוף ורבייה. יחד, מודל המיקרוביום של C. elegans מאפשר למסכים בעלי תפוקה גבוהה לאתר את הגורמים המטבוליים והגנטיים המווסתים את הפיזיולוגיה של המאכסן.
Protocol
Representative Results
Discussion
ורמימטריית זרימה שימשה לאפיון גנים ומסלולים של C. elegans כנגד התיישבות פתוגנים ורעילות במספר מחקרים21,22. כאן, מוצגת גישה מקובלת בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- C. elegans כדי לחקור כיצד מיקרוביום המעי מווסת את הפיזיולוגיה המארחת שלהם. בהשוואה לשיטות קיימות המ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH DP2DK116645 (ל- B.S.S.), פרס הטייס של קרן דאן ומענק נאס”א 80NSSC22K0250 (ל- B.S.S). פרויקט זה נתמך גם על ידי Cytometry and Cell Sorting Core במכללת ביילור לרפואה במימון פרס CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), ה-NIH (S10 OD025251, CA125123 ו-RR024574), ובסיועו של ג’ואל מ. סדרסטרום, בתוספת מענק מכשור למענק LPS NIH (S10 OD025251). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. . tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Génétique. 207 (2), 447-463 (2017).
