예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용
Summary
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.
Abstract
장내 마이크로바이옴의 구성은 동물의 발달과 생활 전반에 걸쳐 숙주 생리학에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 마이크로바이옴의 조성 변화를 측정하는 것은 이러한 생리적 변화 사이의 기능적 관계를 식별하는 데 매우 중요합니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )은 숙주-마이크로바이옴 상호작용의 분자 동인을 조사하기 위한 강력한 숙주 시스템으로 부상했습니다. 투명한 신체 구조와 형광 태그가 부착된 천연 미생물을 통해 개별 예쁜꼬마선 충 동물의 장내 미생물 군집 내 미생물의 상대적 수준은 대형 입자 분류기를 사용하여 쉽게 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 마이크로바이옴의 실험적 설정, 원하는 생애 단계에서 예쁜꼬마선충 개체군의 수집 및 분석, 분류기의 작동 및 유지 관리, 결과 데이터 세트의 통계 분석을 위한 절차를 설명합니다. 또한 관심 미생물을 기반으로 분류기 설정을 최적화하기 위한 고려 사항, 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 생애 단계에 대한 효과적인 게이팅 전략 개발, 장내 마이크로바이옴 구성을 기반으로 동물 개체군을 풍부하게 하기 위해 선별기 기능을 활용하는 방법에 대해서도 논의합니다. 잠재적인 응용 프로그램의 예가 프로토콜의 일부로 제시되며, 여기에는 처리량이 많은 응용 프로그램으로의 확장 가능성이 포함됩니다.
Introduction
동물의 진화는 끊임없는 미생물의 영향을 받고 있다1. 동물 숙주는 환경의 다양한 미생물로부터 숙주의 능력을 확장하고 생리적 특성과 질병에 대한 감수성을 촉진하는 특정 파트너2를 획득한다3. 예를 들어, 장내 마이크로바이옴에 대한 메타게놈 분석은 비만 마우스에서 더 많은 에너지 수확 및 저장을 제공할 수 있는 미생물 유전자의 풍부한 대사 클래스를 밝혀냈으며4 그 중 다수는 인간의 장내 마이크로바이옴에서도 발견된다5. 인과 관계를 확립하고 마이크로바이옴 영향의 분자 결정 요인을 정확히 찾아내야 할 필요성이 여전히 크지만, 대규모 스크리닝에 대한 숙주 시스템의 마이크로바이옴 복잡성과 다루기 쉬움으로 인해 진전이 방해를 받고 있습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans) 모델 유기체는 마이크로바이옴과 숙주 생리학 간의 연관성에 대한 분자적 이해를 증진할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 점막층과 융모 구조를 가진 20개의 장 세포를 가지고 있습니다. 이 세포는 미생물 생성물을 감지하고 잠재적으로 장내 집락을 조절하는 항균 분자를 생성하는 풍부한 화학 수용체 유전자를 갖추고 있습니다 6,7. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 보존된 생물학은 인슐린 신호전달, TGF-beta 및 MAP Kinase 8,9,10을 포함하여 장내 미생물을 조절하는 숙주 신호전달에 대한 엄청난 수의 발견으로 이어졌습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)은 발달 중 성장을 위한 식단과 성인이 된 마이크로바이옴 모두에서 미생물을 활용합니다. 나이가 들어감에 따라 일부 미생물은 장 내강에 과도하게 축적될 수 있으며, 숙주-미생물 관계는 공생에서 발병 기전으로 바뀔 수 있다11. 자연 서식지에서 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 다양한 박테리아 종을 만난다12,13. 자연 서식지(썩은 과일, 식물 줄기 및 동물 벡터)에서 수집된 대표 샘플에서 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 자연 마이크로바이옴은 프로테오박테리아(Proteobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 피르미쿠테스(Firmicutes), 악티노박테리아(Actinobacteria) 등 4가지 박테리아 문(phyla)이 지배적이라는 사실이 밝혀졌습니다. 이러한 구분 내에는 서식지12,13,14,15에 따라 박테리아의 다양성과 풍부함에 큰 차이가 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구 커뮤니티17를 위해 만들어진 최고의 마이크로바이옴 속(genera)을 대표하는 63명의 회원(BIGbiome)16 및 12명의 회원(CeMbio) 컬렉션을 포함하여 여러 정의된 커뮤니티가 구축되었습니다. 마이크로바이옴과 구성 균주는 모두 예쁜꼬마선충의 생리학에 신체 크기, 성장 속도 및 스트레스 반응과 같은 다양한 영향을 미칠 수 있습니다 9,16,17. 이러한 연구는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 마이크로바이옴 연구의 모델로 확립하기 위한 리소스와 사례를 제공합니다.
여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 시스템을 활용하여 인구 규모에서 마이크로바이옴 구성과 숙주 생리학의 기본 측정을 동시에 측정하는 대형 입자 분류기(LPS) 기반 워크플로우(그림 1)를 제시합니다. 미생물 측면에서, 워크플로우는 정의된 마이크로바이옴 또는 단일 미생물을 조합하여 증가하는 미생물 상호 작용과 함께 군집의 견고성과 가소성을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 숙주 측에서 워크플로우를 통해 고처리량 분석을 통해 마이크로바이옴에서 형광 미생물의 집락화 수준을 측정하고 발달, 신체 크기 및 번식 측면에서 숙주 생리학적 판독을 수행할 수 있습니다. 종합하면, 예쁜꼬마선충(C. elegans) 마이크로바이옴 모델은 숙주 생리학을 조절하는 대사 및 유전적 결정 요인을 정확히 찾아낼 수 있는 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유동 지렁이 측정법은 여러 연구에서 병원균 집락화 및 독성에 대한 예쁜꼬마선충 유전자 및 경로를 특성화하는 데 사용되었습니다21,22. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 사용하여 장내 마이크로바이옴이 숙주 생리학을 조절하는 방법을 조사하는 고처리량 조정 가능한 접근법을 제시합니다. 콜로니 형성 단위(CFU) 또는 16S rRNA 앰플리?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 DP2DK116645(B.S.S.), Dunn Foundation 파일럿 상 및 NASA 보조금 80NSSC22K0250(B.S.S.)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 베일러 의과대학의 세포분석 및 세포 분류 코어(Cytometry and Cell Sorting Core)의 지원을 받아 CPRIT Core Facility Support Award(CPRIT-RP180672), NIH(S10 OD025251, CA125123 및 RR024574), Joel M. Sederstrom의 지원과 LPS NIH 보조금(S10 OD025251)을 위한 계측 보조금을 받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 CGC에 의해 제공되었습니다.
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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