Anvendelse av strømningsvermimetri for kvantifisering og analyse av Caenorhabditis elegans tarmmikrobiom
Summary
Caenorhabditis elegans er en kraftig modell for å undersøke molekylære determinanter som driver vertsmikrobiom-interaksjoner. Vi presenterer en rørledning med høy gjennomstrømning som profilerer enkeltdyrnivåene av tarmmikrobiomkolonisering sammen med viktige aspekter ved C. elegans-fysiologien.
Abstract
Sammensetningen av tarmmikrobiomet kan ha en dramatisk innvirkning på vertsfysiologien gjennom utviklingen og dyrets liv. Måling av sammensetningsendringer i mikrobiomet er avgjørende for å identifisere de funksjonelle forholdene mellom disse fysiologiske endringene. Caenorhabditis elegans har dukket opp som et kraftig vertssystem for å undersøke molekylære drivere av vertsmikrobiominteraksjoner. Med sin gjennomsiktige kroppsplan og fluorescerende merkede naturlige mikrober, kan de relative nivåene av mikrober i tarmmikrobiomet til et individuelt C. elegans-dyr enkelt kvantifiseres ved hjelp av en stor partikkelsortering. Her beskriver vi prosedyrene for eksperimentelt oppsett av et mikrobiom, innsamling og analyse av C. elegans-populasjoner i ønsket livsstadium, drift og vedlikehold av sortereren, og statistiske analyser av de resulterende datasettene. Vi diskuterer også hensyn for optimalisering av sorteringsinnstillinger basert på mikrober av interesse, utvikling av effektive gatingstrategier for C. elegans livsstadier, og hvordan man kan utnytte sorteringsevner for å berike dyrepopulasjoner basert på tarmmikrobiomsammensetning. Eksempler på potensielle applikasjoner vil bli presentert som en del av protokollen, inkludert potensialet for skalerbarhet til applikasjoner med høy gjennomstrømning.
Introduction
Dyrs evolusjon er under konstant mikrobiell påvirkning1. Fra ulike mikrober i miljøet får dyreverter spesifikke partnere2 som utvider vertens evner og driver dens fysiologi og følsomhet for sykdom3. For eksempel avdekket metagenomiske analyser av tarmmikrobiomet berikede metabolske klasser av mikrobielle gener som kan gi større energihøsting og lagring hos overvektige mus4, hvorav mange også finnes i det humane tarmmikrobiomet5. Det er fortsatt et stort behov for å etablere årsakssammenhenger og finne molekylære determinanter for mikrobiompåvirkningen, selv om fremgangen har blitt hindret av mikrobiometkompleksiteten og trekkbarheten til vertssystemer til storskala screening.
Modellorganismen C. elegans gir en plattform for å fremme molekylær forståelse av koblinger mellom mikrobiom og vertsfysiologi. C. elegans har 20 tarmceller med et slimhinnelag og villi-strukturer. Disse cellene er utstyrt med rikelig kjemoreceptorgener som sanser mikrobielle produkter og produserer antimikrobielle molekyler som potensielt regulerer tarmkolonisatorene 6,7. Denne konserverte biologien til C. elegans har ført til et enormt antall funn i vertssignalering som regulerer tarmmikrober, inkludert insulinsignalering, TGF-beta og MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans bruker mikrober som både deres diett for vekst under utvikling og mikrobiom som voksne. Med alderdommen kan noen mikrober overakkumuleres i tarmlumen, og vertsmikrobeforholdet skifter fra symbiose til patogenese11. I sine naturlige habitater møter C. elegans et bredt spekter av bakteriearter12,13. Sekvensering av 16S rDNA fra representative prøver samlet inn i naturlige habitater (råtne frukter, plantestamme og dyrevektorer) avslørte at det naturlige mikrobiomet til C. elegans domineres av fire bakterielle phyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria. Innenfor disse divisjonene ligger stor variasjon i bakteriens mangfold og rikdom basert på habitatet12,13,14,15. Flere definerte samfunn har blitt etablert, inkludert samlingene med 63 medlemmer (BIGbiome)16 og 12-medlemmer (CeMbio) som representerer de beste mikrobiomslektene opprettet for C. elegans forskningssamfunn17. Både mikrobiomer og komponentstammer kan ha en variert innvirkning på fysiologien til C. elegans som kroppsstørrelse, vekstrater og stressresponser 9,16,17. Disse studiene gir ressurser og eksempler for å etablere C. elegans som en modell for mikrobiomforskning.
Her presenteres en stor partikkelsorterer (LPS) basert arbeidsflyt (figur 1) som bruker C. elegans-systemet til samtidig å måle mikrobiomsammensetning og grunnleggende mål på vertsfysiologi på populasjonsskalaen. Fra den mikrobielle siden kan arbeidsflyten tilpasses for å sette sammen et definert mikrobiom eller enkeltmikrober for å teste robustheten og plastisiteten i samfunnet med økende mikrobielle interaksjoner. Fra vertssiden muliggjør arbeidsflyten høye gjennomstrømningsanalyser for å måle koloniseringsnivåer av fluorescerende mikrober i mikrobiomet og vertsfysiologisk avlesning når det gjelder utvikling, kroppsstørrelse og reproduksjon. Samlet sett muliggjør C. elegans mikrobiommodell skjermer med høy gjennomstrømning for å finne de metabolske og genetiske determinantene som modulerer vertsfysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flow vermimetry har blitt brukt til å karakterisere C. elegans gener og veier mot patogen kolonisering og toksisitet i flere studier21,22. Her presenteres en høy gjennomstrømnings mottagelig tilnærming som bruker C. elegans for å undersøke hvordan intestinale mikrobiomer modulerer vertsfysiologien. Sammenlignet med eksisterende metoder som bruker kolonidannende enheter (CFU) eller 16S rRNA-amplikonsekvensering 9,16,17,23,24<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd DP2DK116645 (til BSS), Dunn Foundation pilot award og NASA grant 80NSSC22K0250 (til BSS). Dette prosjektet ble også støttet av Cytometry and Cell Sorting Core ved Baylor College of Medicine med finansiering fra CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 og RR024574), og assistanse fra Joel M. Sederstrom, pluss et instrumenteringsstipend for LPS NIH-stipendet (S10 OD025251). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M. et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H. et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F. et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J. et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R. et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science (New York, N.Y.). 312 (5778), 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 1-29 (2006).
- Couillault, C. et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H. et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M. et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A. et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science (New York, N.Y.). 300 (5627), 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M.-A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), E3941-E3949 (2016).
- Dirksen, P. et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M. et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F. et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F. et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618.e9 (2021).
- Dirksen, P. et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda, Md.). 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 1-11 (2006).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. (2018).
- Wickham, H. et al. tidyverse. (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137) (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85) (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F. et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J. et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), e01877-18 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P. et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 1-26 (2014).
- Mok, C. A. et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).
