Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.
Abstract
La composición del microbioma intestinal puede tener un impacto dramático en la fisiología del huésped a lo largo del desarrollo y la vida del animal. La medición de los cambios en la composición del microbioma es crucial para identificar las relaciones funcionales entre estos cambios fisiológicos. Caenorhabditis elegans ha surgido como un poderoso sistema huésped para examinar los impulsores moleculares de las interacciones huésped-microbioma. Con su plan corporal transparente y sus microbios naturales marcados con fluorescente, los niveles relativos de microbios dentro del microbioma intestinal de un animal individual de C. elegans se pueden cuantificar fácilmente utilizando un clasificador de partículas grandes. Aquí describimos los procedimientos para la configuración experimental de un microbioma, la recolección y el análisis de las poblaciones de C. elegans en la etapa de vida deseada, la operación y el mantenimiento del clasificador, y los análisis estadísticos de los conjuntos de datos resultantes. También discutimos las consideraciones para optimizar la configuración del clasificador en función de los microbios de interés, el desarrollo de estrategias efectivas de compuerta para las etapas de vida de C. elegans y cómo utilizar las capacidades del clasificador para enriquecer las poblaciones de animales en función de la composición del microbioma intestinal. Como parte del protocolo, se presentarán ejemplos de posibles aplicaciones, incluido el potencial de escalabilidad a aplicaciones de alto rendimiento.
Introduction
La evolución animal está sometida a una constante influencia microbiana1. A partir de diversos microbios en el medio ambiente, los huéspedes animales adquieren socios específicos2 que amplían las capacidades del huésped e impulsan su fisiología y susceptibilidad a las enfermedades3. Por ejemplo, los análisis metagenómicos del microbioma intestinal revelaron clases metabólicas enriquecidas de genes microbianos que pueden conferir una mayor recolección y almacenamiento de energía en ratones obesos4, muchos de los cuales también se encuentran en el microbioma intestinal humano5. Todavía existe una gran necesidad de establecer relaciones causales e identificar los determinantes moleculares del impacto del microbioma, aunque el progreso se ha visto obstaculizado por las complejidades del microbioma y la capacidad de tratamiento de los sistemas huéspedes para el cribado a gran escala.
El organismo modelo C. elegans proporciona una plataforma para avanzar en la comprensión molecular de los vínculos entre el microbioma y la fisiología del huésped. C. elegans posee 20 células intestinales con una capa mucosa y estructuras de vellosidades. Estas células están equipadas con abundantes genes quimiorreceptores que detectan productos microbianos y producen moléculas antimicrobianas que potencialmente regulan a sus colonizadores intestinales 6,7. Esta biología conservada de C. elegans ha dado lugar a un gran número de descubrimientos en la señalización del huésped que regula los microbios intestinales, incluida la señalización de la insulina, el TGF-beta y la quinasa MAP 8,9,10.
C. elegans utiliza microbios como su dieta para crecer durante el desarrollo y microbioma como adultos. Con la vejez, algunos microbios pueden acumularse en exceso en la luz intestinal y la relación huésped-microbio pasa de la simbiosis a la patogénesis11. En su hábitat natural, C. elegans se encuentra con una amplia gama de especies bacterianas12,13. La secuenciación del ADNr 16S a partir de muestras representativas recogidas en hábitats naturales (frutas podridas, tallos de plantas y vectores animales) reveló que el microbioma natural de C. elegans está dominado por cuatro filos bacterianos: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria. Dentro de estas divisiones se encuentra una gran variación en la diversidad y riqueza de bacterias con base en el hábitat12,13,14,15. Se han establecido varias comunidades definidas, incluidas las colecciones de 63 miembros (BIGbiome)16 y 12 miembros (CeMbio) que representan los principales géneros de microbiomas creados para la comunidad de investigación de C. elegans 17. Tanto los microbiomas como las cepas componentes pueden tener un impacto diverso en la fisiología de C. elegans, como el tamaño corporal, las tasas de crecimiento y las respuestas al estrés 9,16,17. Estos estudios proporcionan recursos y ejemplos para establecer a C. elegans como un modelo para la investigación del microbioma.
Aquí se presenta un flujo de trabajo basado en un clasificador de partículas grandes (LPS) (Figura 1) que utiliza el sistema C. elegans para medir simultáneamente la composición del microbioma y las medidas básicas de la fisiología del huésped a escala poblacional. Desde el punto de vista microbiano, el flujo de trabajo es adaptable para ensamblar un microbioma definido o microbios individuales para probar la robustez y plasticidad de la comunidad con interacciones microbianas cada vez mayores. Desde el lado del huésped, el flujo de trabajo permite realizar ensayos de alto rendimiento para medir los niveles de colonización de microbios fluorescentes en el microbioma y la lectura fisiológica del huésped en términos de desarrollo, tamaño corporal y reproducción. En conjunto, el modelo de microbioma de C. elegans permite que las pantallas de alto rendimiento identifiquen los determinantes metabólicos y genéticos que modulan la fisiología del huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vermimetría de flujo se ha utilizado para caracterizar los genes y las vías de C. elegans contra la colonización y toxicidad de patógenos en varios estudios21,22. Aquí, se presenta un enfoque de alto rendimiento que utiliza C. elegans para investigar cómo los microbiomas intestinales modulan la fisiología de su huésped. En comparación con los métodos existentes que utilizan unidades formadoras de colonias (UFC) o secuenciación de a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH DP2DK116645 (a B.S.S.), el premio piloto de la Fundación Dunn y la subvención de la NASA 80NSSC22K0250 (a B.S.S.). Este proyecto también contó con el apoyo del Centro de Citometría y Clasificación Celular de Baylor College of Medicine con fondos del Premio de Apoyo a las Instalaciones Centrales de CPRIT (CPRIT-RP180672), los NIH (S10 OD025251, CA125123 y RR024574) y la asistencia de Joel M. Sederstrom, además de una subvención de instrumentación para la subvención de los NIH de LPS (S10 OD025251). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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