اختبار العلاجات المناعية للسرطان في نموذج فأر متوافق مع البشر يحمل أوراما بشرية
Summary
يحدد هذا البروتوكول جيل فئران الجهاز المناعي البشري (HIS) لدراسات الأورام المناعية. يتم تقديم التعليمات والاعتبارات في استخدام هذا النموذج لاختبار العلاجات المناعية البشرية على الأورام البشرية المزروعة في هذا النموذج مع التركيز على توصيف استجابة جهاز المناعة البشري للورم.
Abstract
يعد عكس الطبيعة المثبطة للمناعة للبيئة المكروية للورم أمرا بالغ الأهمية لنجاح علاج السرطانات بأدوية العلاج المناعي. نماذج سرطان الفئران محدودة للغاية في تنوعها وتعاني من ضعف الترجمة إلى العيادة. ليكون بمثابة نموذج ما قبل سريري أكثر فسيولوجية لدراسات العلاج المناعي ، تم تطوير هذا البروتوكول لتقييم علاج الأورام البشرية في الفأر المعاد تشكيله مع جهاز المناعة البشري. يوضح هذا البروتوكول الفريد تطور فئران الجهاز المناعي البشري (HIS ، “الإنسانية”) ، يليها زرع ورم بشري ، إما طعم أجنبي مشتق من خط الخلية (CDX) أو طعم أجنبي مشتق من المريض (PDX). يتم إنشاء الفئران HIS عن طريق حقن الخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 + البشرية المعزولة من دم الحبل السري في BRGS حديثي الولادة (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) الفئران عالية نقص المناعة القادرة أيضا على قبول ورم غريب المنشأ. يتم التأكيد على أهمية حركية وخصائص تطور جهاز المناعة البشري وزرع الورم. أخيرا ، يتم وصف تقييم متعمق للبيئة المكروية للورم باستخدام قياس التدفق الخلوي. في العديد من الدراسات باستخدام هذا البروتوكول ، وجد أن البيئة المكروية للورم للأورام الفردية يتم تلخيصها في الفئران HIS-PDX. تظهر الأورام “الساخنة” تسلل مناعي كبير بينما لا تظهر الأورام “الباردة”. يعمل هذا النموذج كأرض اختبار للعلاجات المناعية المركبة لمجموعة واسعة من الأورام البشرية ويمثل أداة مهمة في البحث عن الطب الشخصي.
Introduction
تعد نماذج سرطان الفئران مهمة لإنشاء آليات أساسية لنمو الورم والهروب المناعي. ومع ذلك ، فقد أسفرت دراسات علاج السرطان في نماذج الفئران عن ترجمة محدودة للعيادة بسبب النماذج الجينية المحدودة والاختلافات الخاصة بالأنواع 1,2. أكد ظهور العلاجات المناعية كنهج مهيمن للسيطرة على الأورام الحاجة إلى نموذج في الجسم الحي مع جهاز مناعة بشري وظيفي. جعلت التطورات في فئران الجهاز المناعي البشري (HIS MICE) على مدى العقد الماضي من الممكن دراسة علم الأورام المناعي في الجسم الحي في مجموعة واسعة من أنواع السرطان وعوامل العلاج المناعي3،4،5،6. تنمو نماذج الأورام البشرية ، بما في ذلك الطعوم الخارجية المشتقة من خط الخلية والمشتقة من المريض (CDX و PDX ، على التوالي) ، بشكل جيد في فئران HIS وفي معظم الحالات تكون متطابقة تقريبا مع نموها في المضيف الذي يعاني من نقص المناعة والذي يفتقر إلى تطعيم المكونة للدمالبشري 7,8. بناء على هذه النتيجة الرئيسية ، يستخدم الباحثون نموذج الماوس HIS لدراسة العلاجات المناعية البشرية ، بما في ذلك العلاجات المركبة المصممة لتغيير البيئة المكروية للورم (TME) لتقليل كبت المناعة وبالتالي تعزيز قتل الورم الموجه للمناعة. تساعد هذه النماذج قبل السريرية في معالجة قضايا عدم تجانس السرطانات البشرية ، ويمكنها أيضا التنبؤ بنجاح العلاج وكذلك مراقبة سمية الأدوية المرتبطة بالمناعة 9,10.
يتطلب إنتاج نموذج فأر مع جهاز المناعة البشري من خلال إدخال الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية فأرا يعاني من نقص المناعة المتلقي الذي لن يرفض الطعم الخارجي. تستمد نماذج الفئران الحالية HIS من سلالات الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتي تم الإبلاغ عنها منذ أكثر من 30 عاما. كانت أول سلالة فأر تعاني من نقص المناعة تم وصفها هي فئران SCID التي تفتقر إلى الخلايا التائية والبائية11 ، تليها NOD-SCID الهجين مع تعدد أشكال SIRPα المسؤول عن تحمل بلاعم الفئران للخلايا البشرية ، بسبب زيادة ارتباط أليل NOD SIRPα بجزيء CD47 البشري12,13. في أوائل عام 2000 ، كان حذف سلسلة جاما الشائعة لمستقبلات IL-2 (IL-2Rγc) على كل من سلالات نقص المناعة BALB / c و NOD بمثابة تغيير لقواعد اللعبة لتعزيز النقش البشري ، بسبب الحذف الجيني الذي يمنع تطوير الخلايا القاتلة الطبيعية المضيفة14،15،16،17. النماذج البديلة ، مثل الفئران BRG و NRG ، تحقق نقص الخلايا التائية والبائية من خلال حذف جين Rag1 أو Rag2 ، المطلوب لإعادة ترتيب جين مستقبلات الخلايا التائية والبائية وبالتالي نضوج وبقاء الخلايا الليمفاوية18,19. يجمع فأر BRGS (BALB / c -Rag2nullIl2RγCnullSirpα NOD) المستخدم هنا بين نقص سلسلة IL-2Rγ وأليلNOD SIRPα على خلفية Rag2 / – ، مما يؤدي إلى فأر يعاني من نقص المناعة بدرجة عالية بدون خلايا T أو B أو NK ، ولكن بقوة وصحة كافية للسماح بالتطعيم على المدى الطويل لأكثر من 30 أسبوعا13.
يمكن إنشاء فئران HIS بطرق متعددة ، مع كون حقن PBMC البشري هو الطريقة الأكثر مباشرة15،18،20. ومع ذلك ، فإن هذه الفئران لديها توسع واضح في الخلايا التائية البشرية المنشطة التي تؤدي إلى مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) بحلول 12 أسبوعا من العمر ، مما يمنع الدراسات طويلة الأجل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية من دم الحبل السري (CB) ونخاع العظام وكبد الجنين لتطعيم وإنتاج جهاز المناعة البشري من جديد. في هذا النظام ، تنتج الخلايا الجذعية المكونة للدم جهازا مناعيا بشريا متعدد السلالات مع توليد الخلايا المناعية T و B والخلايا المناعية الفطرية التي تتحمل مضيف الفأر بشكل مهم ، مقارنة بالفئران PBMC التي تطور في الغالب الخلايا التائية. لذلك ، فإن GVHD غائب أو متأخر بشكل كبير ، ويمكن تمديد الدراسات لتشمل الفئران حتى عمر 10 أشهر. يوفر CB مصدرا سهلا ويمكن الوصول إليه وغير جراحي للخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية CD34 + التي تسهل تطعيم العديد من فئران HIS بأجهزة مناعية متطابقة وراثيا17،18،20،21. على مدى السنوات القليلة الماضية ، تم استخدام نماذج الفئران HIS على نطاق واسع لدراسة العلاج المناعي و TME3،4،5،6. على الرغم من تطور أجهزة المناعة المشتقة من الإنسان في هذه الفئران ، تنمو أورام الطعم الأجنبي البشري بمعدلات مماثلة مقارنة بالفئران التي تعاني من نقص المناعة وتسمح بالتفاعل المعقد بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية ، وهو أمر مهم للحفاظ على البيئة المكروية ل PDX3،7،8 . تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء أكثر من 50 دراسة لاختبار العلاجات في الفئران HIS-BRGS مع PDXs و CDXs. الاستنتاج المهم هو أن الأورام البشرية في فئران HIS تحافظ على TME الفريد الخاص بها كما هو محدد من خلال التقييم الجزيئي للورم بالنسبة لعينة المريض الأولية وخصائص التسلل المناعي3،22،23. تركز مجموعتنا على التقييم المتعمق ل HIS في كل من الأعضاء المناعية والورم باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. هنا ، نصف بروتوكولا لإضفاء الطابع الإنساني على الفئران BRGS ، وتقييم الخيمرية ، وزرع الأورام البشرية ، وقياسات نمو الورم ، وإدارة علاج السرطان ، وتحليل خلايا HIS عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
على مدى السنوات ال 6 الماضية ، باستخدام خبرتنا في كل من علم المناعة والفئران الإنسانية ، طور فريق البحث لدينا نموذجا قبل سريريا تشتد الحاجة إليه لاختبار العلاجات المناعية على مجموعة متنوعة من الأورام البشرية3،7،30،31. يؤ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر كلا من مرفق أبحاث الحيوان (OLAR) على رعايتهم للفئران لدينا ، ومورد قياس التدفق الخلوي المشترك المدعوم من منحة دعم مركز السرطان (P30CA046934) في معهدنا لمساعدتهم الهائلة في جميع أعمالنا. كما نعرب عن تقديرنا لكل من غيل إيكهاردت وآنا كاباسو لتعاوننا الافتتاحي في دراسة العلاجات المناعية ل PDXs البشرية في نموذج HIS-BRGS الخاص بنا. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة P30CA06934 منحة دعم مركز السرطان باستخدام الموارد المشتركة PHISM (نماذج فأر جهاز المناعة البشري قبل السريرية) ، RRID: SCR_021990 ومورد قياس التدفق الخلوي المشترك ، RRID: SCR_022035. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل NIAID التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب العقد رقم 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
References
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
