ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験
Summary
このプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系(HIS)マウスの生成について概説しています。このモデルに移植されたヒト腫瘍に対するヒト免疫療法を試験するためのこのモデルの使用における指示および考慮事項は、腫瘍に対するヒト免疫系の応答を特徴付けることに重点を置いたものとして提示されている。
Abstract
腫瘍微小環境の免疫抑制性を逆転させることは、免疫療法薬による癌の治療を成功させるために重要です。マウスがんモデルは、その多様性が非常に限られており、臨床への翻訳が不十分です。免疫療法研究のためのより生理学的な前臨床モデルとして役立つために、このプロトコルは、ヒト免疫系で再構成されたマウスにおけるヒト腫瘍の治療を評価するために開発されました。このユニークなプロトコルは、ヒト免疫系(HIS、「ヒト化」)マウスの開発と、それに続く細胞株由来異種移植片(CDX)または患者由来異種移植片(PDX)のいずれかのヒト腫瘍の移植を示しています。HISマウスは、臍帯血から分離したCD34+ヒト造血幹細胞を、異種腫瘍も受け入れることができる新生児BRGS(BALB/c Rag2-/-IL2RγC-/- NODSIRPα)の高免疫不全マウスに注入することによって生成されます。ヒト免疫系の発達と腫瘍移植の動態と特性の重要性が強調されています。最後に、フローサイトメトリーを用いた腫瘍微小環境の詳細な評価について説明します。このプロトコルを使用した多数の研究では、個々の腫瘍の腫瘍微小環境がHIS-PDXマウスで再現されることがわかりました。「熱い」腫瘍は大きな免疫浸潤を示しますが、「冷たい」腫瘍はそうではありません。このモデルは、幅広いヒト腫瘍に対する併用免疫療法の試験場として機能し、個別化医療の探求における重要なツールを表しています。
Introduction
マウスがんモデルは、腫瘍の成長と免疫逃避の基本的なメカニズムを確立するために重要です。しかし、マウスモデルでのがん治療研究では、同系モデルが限られており、種固有の違いがあるため、臨床への翻訳は有限です1,2。腫瘍を制御するための支配的なアプローチとしての免疫療法の出現は、機能的なヒト免疫システムを備えたin vivoモデルの必要性を繰り返し示しています。過去10年間のヒト免疫系マウス(HISマウス)の進歩により、さまざまな種類の癌および免疫療法剤におけるin vivoでの免疫腫瘍学の研究が可能になりました3、4、5、6。細胞株由来および患者由来異種移植片(それぞれCDXおよびPDX)を含むヒト腫瘍モデルは、HISマウスでよく増殖し、ほとんどの場合、ヒト造血生着を欠く免疫不全宿主における増殖とほぼ同じである7,8。この重要な発見に基づいて、研究者はHISマウスモデルを使用して、腫瘍微小環境(TME)を変化させて免疫抑制を低下させ、免疫指向性腫瘍殺傷を強化するように設計された併用療法を含むヒト免疫療法を研究しています。これらの前臨床モデルは、ヒト癌の不均一性の問題に対処するのに役立ち、治療の成功を予測し、免疫関連の薬物毒性を監視することもできます9,10。
ヒト造血幹細胞の導入によるヒト免疫系を有するマウスモデルの作製には、異種移植片を拒絶しないレシピエント免疫不全マウスが必要である。現在のHISマウスモデルは、30年以上前に報告された免疫不全マウス系統に由来します。記載された最初の免疫不全マウス系統は、T細胞およびB細胞を欠失したSCIDマウスであり11、続いて、ヒトCD47分子12,13へのNOD SIRPα対立遺伝子の結合の増加により、ヒト細胞に対するマウスマクロファージ耐性に関与するSIRPα多型を有するハイブリッドNOD-SCIDが続いた。2000年代初頭、BALB/cとNODの両方の免疫不全株におけるIL-2受容体(IL-2Rγc)の共通ガンマ鎖の欠失は、宿主NK細胞の発生を禁止する遺伝子欠失により、ヒト生着増強のゲームチェンジャーでした14,15,16,17。BRGおよびNRGマウスなどの代替モデルは、TおよびB細胞受容体遺伝子の再配列、したがってリンパ球の成熟および生存に必要なRag1またはRag2遺伝子の欠失を通じてTおよびB細胞欠損を達成する18,19。本明細書で用いられるBRGS(BALB/c -Rag2ヌルIl2RγCヌルSirpα NOD)マウスは、IL-2Rγ鎖欠損症とRag2-/-バックグラウンド上のNOD SIRPα対立遺伝子を結合し、T、B、またはNK細胞を持たないが、30週以上の長期生着を可能にするのに十分な活力と健康を備えた高度に免疫不全マウスをもたらす13。
HISマウスは複数の方法で生成することができ、ヒトPBMC注射が最も直接的な方法である15、18、20。しかし、これらのマウスは、活性化ヒトT細胞の顕著な増殖を有し、12週齢までに移植片対宿主病(GVHD)をもたらし、長期研究を妨げる。あるいは、臍帯血(CB)、骨髄、および胎児肝臓からのヒト造血幹細胞も、ヒト免疫系の生着および産生に使用することができる。このシステムでは、造血幹細胞は、主にT細胞を発達させるPBMCマウスと比較して、マウス宿主に有意に耐性のあるT、B、および自然免疫細胞の生成を伴う多系統のヒト免疫系を産生する。したがって、GVHDは存在しないか、大幅に遅延し、研究は10ヶ月齢までのマウスに拡張することができる。CBは、遺伝的に同一の免疫系を持つ複数のHISマウスの生着を促進する、CD34+ヒト造血幹細胞の簡単でアクセスしやすい非侵襲的な供給源を提供します17、18、20、21。過去数年間、HISマウスモデルは免疫療法およびTME 3,4,5,6の研究に広く使用されてきました。これらのマウスではヒト由来の免疫系が発達しているにもかかわらず、ヒト異種移植片腫瘍は対照免疫不全マウスと比較して同様の速度で成長し、生着したPDXの微小環境を維持するために重要な癌細胞と免疫細胞の間の複雑な相互作用を可能にします3,7,8.このプロトコルは、PDXおよびCDXを使用したHIS-BRGSマウスで治療をテストする50を超える研究を実施するために使用されています。重要な結論は、HISマウスのヒト腫瘍は、最初の患者サンプルおよび免疫浸潤特性に対する腫瘍の分子評価によって定義される独自のTMEを維持することである3、22、23。私たちのグループは、マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して、免疫器官と腫瘍の両方におけるHISの詳細な評価に焦点を当てています。本明細書では、BRGSマウスのヒト化、キメラの評価、ヒト腫瘍の移植、腫瘍増殖測定、癌治療投与、およびフローサイトメトリーによるHIS細胞の解析のためのプロトコールを記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去6年間、免疫学とヒト化マウスの両方の専門知識を使用して、私たちの研究チームは、さまざまなヒト腫瘍の免疫療法をテストするために非常に必要な前臨床モデルを開発しました3、7、30、31。このプロトコルは、免疫療法中心のヒトT細胞集団に特に注意を払いながら、モデルの変動性を考?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マウスの世話をしてくれた動物研究施設(OLAR)と、がんセンター支援助成金(P30CA046934)が支援するフローサイトメトリー共有リソースの両方に、私たちのすべての仕事に多大な支援をしてくださったことに感謝します。また、ゲイル・エックハルトとアンナ・カパソの両氏が、HIS-BRGSモデルでヒトPDXに対する免疫療法を研究する最初の共同研究を行ったことに感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所のP30CA06934がんセンター支援助成金によって、PHISM(前臨床ヒト免疫系マウスモデル)共有リソースRRID:SCR_021990およびフローサイトメトリー共有リソース(RRID:SCR_022035)を使用して部分的にサポートされました。この研究の一部は、契約番号75N93020C00058の下で国立衛生研究所のNIAIDによってサポートされました。
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
References
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
