Spontan murinmodell av anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft

Summary

Her presenterer vi en standard rørledning for å oppnå murine ATC-svulster ved spontane genetisk konstruerte musemodeller. Videre presenterer vi tumordynamikk og patologisk informasjon om de primære og metastaserte lesjonene. Denne modellen vil hjelpe forskere til å forstå tumorigenese og legge til rette for narkotikafunn.

Abstract

Anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft (ATC) er en sjelden, men dødelig malignitet med en dyster prognose. Det er et presserende behov for mer grundig forskning på karsinogenese og utvikling av ATC, samt terapeutiske metoder, siden standardbehandlinger i hovedsak er utarmet hos ATC-pasienter. Lav prevalens har imidlertid hemmet grundige kliniske studier og innsamling av vevsprøver, så lite fremgang har blitt oppnådd i å skape effektive behandlinger. Vi brukte genteknologi for å lage en betinget induserbar ATC murine modell (mATC) i en C57BL/6 bakgrunn. ATC-murinmodellen ble genotypet av TPO-cre/ERT2; Braf^{CA / wt}; Trp53 ex2-10^/ex2-10 og indusert ved intraperitoneal injeksjon med tamoksifen. Med murinmodellen undersøkte vi tumordynamikken (tumorstørrelse varierte fra 12,4 mm 2 til 32,5 mm² etter 4 måneders induksjon), overlevelse (median overlevelsestid var 130 dager) og metastase (lungemetastaser forekom hos 91,6 % av musene) kurver og patologiske trekk (karakterisert ved Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 og Caspase-3 immunhistokjemisk farging). Resultatene indikerte at spontan mATC har svært lik tumordynamikk og immunologisk mikromiljø til humane ATC-svulster. Som konklusjon, med høy likhet i patofysiologiske trekk og enhetlige genotyper, løste mATC-modellen mangelen på klinisk ATC-vev og prøveheterogenitet til en viss grad. Derfor vil det lette mekanismen og translasjonsstudier av ATC og gi en tilnærming til å undersøke behandlingspotensialet for småmolekylære legemidler og immunterapimidler for ATC.

Introduction

Skjoldbruskkjertelkreft er en av de vanligste endokrine malignitetene¹, som stammer fra skjoldbruskepitelet. De siste årene har forekomsten av kreft i skjoldbruskkjertelen økt raskt på verdensbasis². Skjoldbruskkjertelkreft kan deles inn i forskjellige typer i henhold til graden av tumorcelledifferensiering. På grunnlag av klinisk atferd og histologi deles skjoldbruskkarsinomer inn i godt differensierte karsinomer, inkludert papillær skjoldbruskkarsinom (PTC) og follikulært skjoldbruskkarsinom (FTC), dårlig differensiert karsinom (PDTC) og udifferensiert eller anaplastisk karsinom i skjoldbruskkjertelen (ATC)³. I motsetning til PTC, som er en vanlig type med mild oppførsel og bedre prognose⁴, er ATC en sjelden og svært aggressiv malignitet som står for 2% til 3% av alle skjoldbruskkjerteltumorer⁵. Selv om ATC er sjelden, er det ansvarlig for omtrent 50% av skjoldbruskkjertelkreftrelaterte dødsfall, med dyster overlevelse (6-8 måneder)^6,7. Over 50% av ATC-tilfellene diagnostiseres som lungemetastase⁸. I tillegg til ATCs aggressive natur er det utviklet begrenset effektiv behandling i klinikken. Derfor har ATC-pasienter en dyster prognose 9,10,11. Dette antyder at det er behov for ytterligere grundige studier av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av ATC og behandling.

Tumorigenese av ATC er en dynamisk dedifferensiert prosess. Vanskeligheten med å samle humane tumorprøver på hvert stadium i kliniske studier har hindret forståelsen av utviklingsmekanismen fra godt differensierte til udifferensierte karsinomer. I motsetning til dette favoriserer bruken av murine ATC-modeller (mATC) innsamling av mATC-prøver i hele tumorigenesekurset. Derfor kan vi bedre forstå mekanismene for tumordannelse ved å analysere den dynamiske dedifferensierte prosessen. I tillegg har heterogeniteten til kliniske ATC-prøver også bidratt til vanskeligheten med å forstå den molekylære mekanismen. Likevel delte mus de samme genetiske bakgrunnene og ble opprettholdt i lignende livsmiljøer, noe som sikret hver svulsts konsistens. Dette gjør det lettere å utforske den generelle rollen til ATC-utvikling^12,13,14. I tillegg er mATC en in situ tumormodell som kan gjenopprette innflytelsen fra den anatomiske plasseringen og vevsspesifikt mikromiljø. Som sådan, sammenlignet med vanlige immundefekte mus, er mATC en spontan murinmodell med et intakt immunsystem og immunmikromiljø.

Derfor konstruerte vi betinget indusert mATC med C57BL/6-stammen, som er en murinmodell som er i stand til å reprodusere de patologiske egenskapene til dedifferensiert tyreoideakarsinom. Basert på denne modellen ga vi en kort oversikt over molekylært grunnlag, konstruksjonsideer, patologiske egenskaper og anvendelser av mATC. I tillegg observerte og rapporterte vi tumorvekst, overlevelsestid, metastase og patologiske trekk ved mATC. Vi tror dette vil være en informatisk oversikt for å hjelpe andre forskere med å bruke denne modellen enklere.

Vi konstruerte en betinget induserbar mATC-modell, som først rapportert av McFadden¹⁵; I utgangspunktet konstruerte vi mus: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt og Trp53^flox/wt. Spesielt inkluderte TPO-cre/ERT2-mus den humane skjoldbruskkjertelperoksidasen (TPO) promotor (en skjoldbruskspesifikk promotor), som drev uttrykket av et cre-ERT2-fusjonsgen (en cre rekombinase fusjonert til et humant østrogenreseptorligandbindende domene). Cre-ERT2 er vanligvis begrenset til cytoplasma og går bare inn i kjernen når den utsettes for tamoksifen, noe som induserer cre for å utøve rekombinant enzymaktivitet. Når musene krysses med mus som bærer loxP-flankerte sekvenser, etter tamoxifen-induksjon, sletter cre-mediert rekombinasjon de floxed sekvensene i skjoldbruskkjertelcellene for å oppnå formålet med å slå ut eller banke inn bestemte gener.

I tillegg er Braf ^{flox / wt-mus} en knock-in allel av menneskelig Braf basert på cre-loxP-systemet. Braf^{flox / wt} murine transcript er kodet av endogene eksoner 1-14 og loxP-flankerte menneskelige eksoner 15-18. Etter cre-mediert eksisjon av floxed regioner, mutant ekson 15 (modifisert med en V600E aminosyresubstitusjon knyttet til konstitutivt aktiv Braf^V600E i humane kreftformer) og endogene eksoner 16-18 brukes til å generere transkripsjoner. Videre er Trp53 ^flox/wt-mus knockout-alleler av humant Trp53 og har loxP-steder som flankerer eksoner 2-10 av Trp53. Når krysset med mus med en cre recombinase, cre-mediert rekombinasjon sletter floxed sekvensen for å slå ut Trp53. Deretter ble TPO-cre/ERT2, Braf flox/w og Trp53^flox/wt-mus krysset for å oppnå TB (TPO-cre^/ERT2; Braf^{flox / wt}) mus og TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^{flox / wt}; Trp53^flox/wt) mus, som kan brukes til å generere PTC og ATC. Etter ca. 8 uker ble musene indusert av en intraperitoneal (i.p.) administrering av 150 mg/kg tamoksifen oppløst i maisolje i to administrasjoner. Tumorvekst kunne overvåkes med høyfrekvent ultralyd (første tidspunkt for ultralyd ble registrert som dag 0). Initial ultralydundersøkelse ble utført 40 dager etter tamoksifenintroduksjon.

Protocol

Dyreprosedyrene beskrevet her ble utført med godkjenning fra dyreetikkomiteen ved West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, Kina. 1. Induksjon av TBP-mus Identifiser musgenotypePå rundt 3 uker, skille hunnmusene fra hannmusene. Bruk samtidig øremerkeklemme for å fikse et øremerke. Plasser øremerkene i nedre halvdel og på den midterste tredjedelen av øret, og sørg for å unngå området med høyest konsentrasjon av kapillærer. …

Representative Results

Vi induserte mATC for å undersøke tumorvekst, musoverlevelsestid og patologiske egenskaper. Etter induksjon ble musene umiddelbart ofret, og prøver (skjoldbruskkjertel, lunge og lever) ble samlet når en av følgende forhold ble funnet: 1) respiratorisk nød forårsaket av tumorkompresjon; 2) redusert appetitt og unormal vokalisering; 3) uvanlig sløvhet; og 4) vekttap på over 20%. Under prøvetakingsprosessen fant vi at alle mus (12/12) dannet svulster etter induksjon. Vi registrerte musens overlevelsestid, tumorege…

Discussion

Kritiske trinn i protokollen for skjoldbrusk tumor disseksjon
Under disseksjon må den anatomiske plasseringen av skjoldbruskkjertelen forstås riktig. Skjoldbruskkjertelen er en sommerfuglformet kjertel som ligger på dorsalsiden av submandibulær kjertel nær skjoldbrusk og luftrøret. Under prosedyren ble kutting av blodårene på begge sider av nakken nøye unngått.

Modifikasjon og feilsøking av mATC-rasen
ATC er en sjelden og svært aggressiv mali…

Materials

100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100