未分化甲状腺癌の自発的マウスモデル
Summary
ここでは、自発的に遺伝子操作されたマウスモデルによってマウスATC腫瘍を取得するための標準パイプラインを提示します。さらに、原発巣と転移病変に関する腫瘍動態と病理学的情報を提示します。このモデルは、研究者が腫瘍形成を理解し、創薬を促進するのに役立ちます。
Abstract
未分化甲状腺がん(ATC)はまれですが致命的な悪性腫瘍であり、予後は悲惨です。ATC患者では標準治療が本質的に枯渇しているため、ATCの発がんと発症、および治療法に関するより詳細な研究が緊急に必要です。しかし、有病率が低いため、徹底的な臨床研究や組織サンプルの採取が妨げられており、効果的な治療法の作成はほとんど進んでいません。遺伝子工学を用いて、C57BL/6バックグラウンドで条件付き誘導性ATCマウスモデル(mATC)を作成しました。ATCマウスモデルはTPO-cre/ERT2によって遺伝子型決定されました。ブラフCA / wt;Trp53ex2-10 / ex2-10およびタモキシフェンによる腹腔内注射によって誘導された。マウスモデルを用いて、腫瘍動態(導入後4ヶ月後の腫瘍サイズは12.4 mm 2から32.5 mm2の範囲)、生存期間(生存期間の中央値は130日)、転移(肺転移はマウスの91.6%で発生した)曲線および病理学的特徴(Cd8、Foxp3、F4/80、Cd206、Ki67、およびCaspase-3免疫組織化学染色によって特徴付けられる)を調査した。その結果、自然発生型mATCはヒトATC腫瘍と高度に類似した腫瘍動態と免疫学的微小環境を有することが示された。結論として、mATCモデルは、病態生理学的特徴と統一された遺伝子型の高い類似性により、臨床ATC組織とサンプルの不均一性の不足をある程度解決しました。したがって、ATCのメカニズムとトランスレーショナル研究を促進し、ATCに対する低分子医薬品と免疫療法剤の治療可能性を調査するためのアプローチを提供します。
Introduction
甲状腺がんは、甲状腺上皮に由来する最も一般的な内分泌悪性腫瘍1の1つです。近年、甲状腺がんの発生率は世界中で急速に増加しています2。甲状腺がんは、腫瘍細胞の分化の程度に応じて異なるタイプに分類できます。甲状腺がんは、臨床行動と組織学に基づいて、甲状腺乳頭がん(PTC)や濾胞性甲状腺がん(FTC)、低分化型がん(PDTC)、甲状腺の未分化がん(ATC)などの高分化型がんに分類されます3。軽度の行動と予後が良好な一般的なタイプであるPTCとは対照的に4、ATCはまれで非常に侵攻性の高い悪性腫瘍であり、すべての甲状腺腫瘍の2%から3%を占めています5。ATCはまれですが、甲状腺がん関連の死亡の約50%の原因であり、生存期間は悲惨です(6〜8か月)6,7。ATC症例の50%以上が肺転移と診断されています8。ATCの攻撃的な性質に加えて、限られた効果的な治療法が診療所で開発されています。したがって、ATC患者は暗い予後を有する9、10、11。このことは、ATCの開発と治療の根底にある分子メカニズムについて、さらなる詳細な研究が緊急に必要であることを示唆しています。
ATCの腫瘍形成は動的な脱分化過程である。臨床研究の各段階でヒト腫瘍サンプルを収集することの難しさは、高分化型癌から未分化癌への発生メカニズムの理解を妨げてきました。対照的に、マウスATCモデル(mATC)の使用は、腫瘍形成過程全体におけるmATCサンプルの収集に有利である。したがって、動的脱分化過程を解析することで、腫瘍形成のメカニズムをよりよく理解することができます。さらに、臨床ATCサンプルの不均一性も、分子メカニズムの理解の難しさの一因となっています。それにもかかわらず、マウスは同じ遺伝的背景を共有し、同様の生活環境で維持され、各腫瘍の一貫性を確保しました。これにより、ATC開発の一般化された役割の調査が容易になります12、13、14。さらに、mATCは、解剖学的位置と組織特異的微小環境の影響を回復できるin situ腫瘍モデルです。このように、一般的に使用される免疫不全マウスと比較して、mATCは無傷の免疫系および免疫微小環境を有する自発的なマウスモデルである。
そこで、脱分化型甲状腺癌の病理学的特徴を再現できるマウスモデルであるC57BL/6株を用いて条件付き誘導mATCを構築した。このモデルに基づいて、mATCの分子基盤、構築のアイデア、病理学的特徴、およびアプリケーションの概要を簡単に説明しました。また,mATCの腫瘍増殖,生存期間,転移,病理学的特徴を観察・報告した.これは、他の研究者がこのモデルを簡単に使用できるようにするための有益な概要になると考えています。
McFadden15によって最初に報告された条件付き誘導性mATCモデルを構築しました。最初に、TPO-cre/ERT2、Braf flox/wt、およびTrp53flox/wtのマウスを作製しました。 具体的には、TPO-cre/ERT2マウスには、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)プロモーター(甲状腺特異的プロモーター)が含まれ、cre-ERT2融合遺伝子(ヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメインに融合したcreリコンビナーゼ)の発現を駆動しました。Cre-ERT2は通常、細胞質に限局し、タモキシフェンにさらされた場合にのみ核に入り、creが組換え酵素活性を発揮するように誘導します。マウスをloxP隣接配列を有するマウスと交配すると、タモキシフェン誘導後、cre媒介組換えにより甲状腺細胞内のfloxed配列が除去され、特定の遺伝子をノックアウトまたはノックする目的が達成されます。
さらに、Brafflox/wtマウスは、cre-loxPシステムに基づくヒトBrafのノックイン対立遺伝子です。Brafflox/wtマウス転写産物は、内因性エクソン1〜14およびloxP隣接ヒトエクソン15〜18によってコードされています。FLOXED領域のcreを介した切除後、変異エクソン15(ヒト癌において構成的に活性なBraf V600Eと結合したV600Eアミノ酸置換で修飾)および内因性エクソン16〜18を使用して転写物を生成します。さらに、Trp53 flox/wtマウスはヒトTrp53のノックアウト対立遺伝子であり、Trp53のエクソン2〜10に隣接するloxP部位を有する。creリコンビナーゼを有するマウスと交配すると、cre媒介組換えは、Trp53をノックアウトするためにフロックス配列を欠失させる。次に、TPO-cre/ERT2、Braf flox/w、およびTrp53flox/wtマウスを交配してTB(TPO-cre/ERT2;ブラフフロックス/重量)マウスおよびTBP(TPO-cre/ERT2;ブラフフロックス/重量;Trp53flox/wt)マウスは、PTCおよびATCを生成するために使用することができる。約8週間後、マウスは、コーン油に溶解した150 mg / kgのタモキシフェンを2回の投与で腹腔内(i.p.)投与することにより誘導されました。腫瘍の成長は高周波超音波検査によってモニターすることができた(超音波検査の最初の時点は0日目として記録された)。最初の超音波検査は、タモキシフェン導入の40日後に実施した。
Protocol
Representative Results
Discussion
甲状腺腫瘍解離のためのプロトコル内の重要なステップ
解剖中、甲状腺の解剖学的位置を正しく理解する必要があります。甲状腺は、顎下腺の背側、甲状軟骨と気管の近くに位置する蝶の形をした腺です。処置中、首の両側の血液動脈を切断することは慎重に避けられました。
mATC品種の修正とトラブルシューティング
ATCはまれで非常に攻?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFA1301203)によってサポートされました。中国国家自然科学財団(82103031、82103918、81973408、82272933);四川大学西中国病院臨床研究インキュベーションプロジェクト(22HXFH019);成都市科学技術局の国際協力プロジェクト(2020-GH02-00017-HZ);四川省自然科学財団、2022NSFSC1314;「四川大学西中国病院の卓越性のための1.3.5プロジェクト」(ZYJC18035、ZYJC18025、ZYYC20003、ZYJC18003);四川科学技術プログラム(2023YFS0098)。
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O’Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -. C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -. P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -. S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
