역형성 갑상선암의 자발적인 쥐 모델
Summary
여기에서 우리는 자발적인 유전자 조작 마우스 모델에 의해 쥐 ATC 종양을 얻기 위한 표준 파이프라인을 제시합니다. 또한, 우리는 원발성 및 전이된 병변에 대한 종양 역학 및 병리학적 정보를 제시합니다. 이 모델은 연구자들이 종양 형성을 이해하고 약물 발견을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.
Abstract
역형성 갑상선암(ATC)은 드물지만 치명적인 악성 종양으로 예후가 좋지 않습니다. ATC 환자에서 표준 치료법이 본질적으로 고갈되기 때문에 치료 방법뿐만 아니라 ATC의 발암 및 개발에 대한 보다 심층적인 연구가 시급합니다. 그러나 낮은 유병률은 철저한 임상 연구와 조직 샘플 수집을 방해하여 효과적인 치료법을 만드는 데 거의 진전이 없었습니다. 우리는 유전 공학을 사용하여 C57BL/6 배경에서 조건부 유도 가능한 ATC 쥐 모델(mATC)을 만들었습니다. ATC 쥐 모델은 TPO-cre/ERT2에 의해 유전자형이 결정되었습니다. 브라프CA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 및 타목시펜으로 복강내 주사로 유도. 쥐 모델을 사용하여 종양 역학(유도 4개월 후 종양 크기는 12.4mm2 내지 32.5mm2 범위), 생존율(평균 생존 기간은 130일) 및 전이(폐 전이는 마우스의 91.6%에서 발생함) 곡선 및 병리학적 특징(Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 및 Caspase-3 면역조직화학적 염색으로 특징지어짐). 결과는 자발적인 mATC가 인간 ATC 종양과 매우 유사한 종양 역학 및 면역학적 미세 환경을 가지고 있음을 나타냅니다. 결론적으로, 병태생리학적 특징과 통일된 유전자형의 높은 유사성으로 mATC 모델은 임상 ATC 조직 및 샘플 이질성의 부족을 어느 정도 해결했습니다. 따라서 ATC의 메커니즘 및 중개 연구를 촉진하고 ATC에 대한 소분자 약물 및 면역요법제의 치료 가능성을 조사하기 위한 접근 방식을 제공할 것입니다.
Introduction
갑상선암은 가장 흔한 내분비 악성 종양 중 하나이다1, 갑상선 상피에서 유래한다. 최근 몇 년 동안 갑상선암의 발병률은 전 세계적으로 급격히 증가하고있습니다 2. 갑상선암은 종양 세포 분화 정도에 따라 크게 종류가 뚜렷할 수 있다. 임상 행동 및 조직학에 기초하여 갑상선 암종은 유두상 갑상선 암종(PTC) 및 여포성 갑상선 암종(FTC), 저분화 암종(PDTC), 미분화 또는 역형성 갑상선 암종(ATC)을 포함한 잘 분화된 암종으로 나뉩니다3. 경미한 행동과 더 나은 예후를 보이는 흔한 유형인 PTC와는 대조적으로4, ATC는 모든 갑상선 종양의 2%에서 3%를 차지하는 희귀하고 매우 공격적인 악성 종양이다5. ATC는 드물지만 갑상선암 관련 사망의 약 50%를 차지하며 생존율(6-8개월)이 낮습니다6,7. ATC 사례의 50% 이상이 폐 전이로 진단된다8. ATC의 공격적인 특성 외에도 클리닉에서 제한된 효과적인 치료법이 개발되었습니다. 따라서 ATC 환자는 암울한 예후를 보입니다 9,10,11. 이는 ATC 및 치료의 발달을 뒷받침하는 분자 메커니즘에 대한 더 심층적인 연구가 시급히 필요함을 시사합니다.
ATC의 종양 형성은 역동적인 역분화 과정입니다. 임상 연구의 각 단계에서 인간 종양 샘플을 수집하는 데 어려움이 있기 때문에 잘 분화된 암종에서 미분화된 암종으로의 발달 메커니즘에 대한 이해가 방해를 받았습니다. 대조적으로, 쥐 ATC 모델(mATC)의 사용은 전체 종양 형성 과정에서 mATC 샘플 수집에 유리합니다. 따라서 우리는 역동적인 역분화 과정을 분석하여 종양 형성 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 또한, 임상 ATC 샘플의 이질성은 분자 메커니즘을 이해하는 데 어려움에 기여했습니다. 그럼에도 불구하고 생쥐는 동일한 유전적 배경을 공유하고 유사한 생활 환경에서 유지되어 각 종양의 일관성을 보장했습니다. 이것은 ATC 개발12,13,14의 일반화된 역할을 탐색하는 것을 용이하게 합니다. 또한, mATC는 해부학적 위치 및 조직 특이적 미세 환경의 영향을 복원할 수 있는 제자리 종양 모델입니다. 따라서 일반적으로 사용되는 면역 결핍 마우스와 비교하여 mATC는 손상되지 않은 면역 체계와 면역 미세 환경을 가진 자발적인 쥐 모델입니다.
따라서 우리는 역분화 갑상선 암종의 병리학적 특징을 재현할 수 있는 쥐 모델인 C57BL/6 균주로 조건부 유도 mATC를 구성했습니다. 이 모델을 기반으로 mATC의 분자 기반, 구성 아이디어, 병리학적 특징 및 응용에 대한 간략한 개요를 제공했습니다. 또한, mATC의 종양 성장, 생존 기간, 전이 및 병리학적 특징을 관찰하고 보고하였다. 우리는 이것이 다른 연구자들이 이 모델을 더 쉽게 사용하는 데 도움이 되는 정보 개요가 될 것이라고 믿습니다.
우리는 McFadden15에 의해 처음 보고된 조건부 유도성 mATC 모델을 구성했습니다. 처음에는 TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt 및 Trp53flox/wt와 같은 마우스를 구성했습니다. 구체적으로, TPO-cre/ERT2 마우스는 cre-ERT2 융합 유전자(인간 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 cre 재조합효소)의 발현을 유도하는 인간 갑상선 과산화효소(TPO) 프로모터(갑상선 특이적 프로모터)를 포함했습니다. Cre-ERT2는 일반적으로 세포질에 국한되어 타목시펜에 노출되었을 때만 핵으로 들어가며, 이는 cre가 재조합 효소 활성을 발휘하도록 유도합니다. 마우스가 loxP-측면 서열을 운반하는 마우스와 교배될 때, 타목시펜 유도 후, cre-매개 재조합은 갑상선 세포에서 플록싱된 서열을 삭제하여 특정 유전자를 녹아웃하거나 노킹하는 목적을 달성합니다.
또한, Braf flox/wt 마우스는 cre-loxP 시스템을 기반으로 하는 인간 Braf의 녹인 대립유전자입니다. Brafflox/wt 쥐 전사체는 내인성 엑손 1-14 및 loxP-측면 인간 엑손 15-18에 의해 암호화됩니다. 플록스된 영역의 cre-매개 절제 후, 돌연변이 엑손 15(인간 암에서 구성적으로 활성인 Braf V600E와 연결된 V600E 아미노산 치환으로 변형됨) 및 내인성 엑손 16-18을 사용하여 전사체를 생성합니다. 또한, Trp53 flox/wt 마우스는 인간 Trp53의 녹아웃 대립유전자이며 Trp53의 엑손 2-10 측면에 loxP 부위가 있습니다. cre 재조합효소가 있는 마우스와 교배될 때, cre-매개 재조합은 플록스된 서열을 삭제하여 Trp53을 녹아웃시킵니다. 그런 다음 TPO-cre/ERT2, Braf flox/w 및 Trp53flox/wt 마우스를 교배하여 TB(TPO-cre/ERT2; 브라프플록스/wt) 마우스 및 TBP(TPO-cre/ERT2; 브라프플록스/wt; Trp53플록스/wt) PTC 및 ATC를 생성하는 데 사용할 수 있는 마우스. 약 8주 후, 마우스는 옥수수 기름에 용해된 150mg/kg 타목시펜을 2회 투여하여 복강내(i.p.) 투여하도록 유도했습니다. 종양 성장은 고주파 초음파로 모니터링할 수 있습니다(초음파의 첫 번째 시점은 0일로 기록됨). 초기 초음파 촬영은 타목시펜 도입 40일 후에 수행되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
갑상선 종양 해부를 위한 프로토콜 내의 중요한 단계
해부하는 동안 갑상선의 해부학 적 위치를 정확하게 이해해야합니다. 갑상선은 갑상선 연골과 기관 근처의 턱밑샘의 등쪽에 위치한 나비 모양의 샘입니다. 시술 과정에서 목 양쪽의 혈액 동맥을 절단하는 것은 조심스럽게 피했습니다.
mATC 품종의 수정 및 문제 해결
ATC는 드물고 매우 공격적인…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2021YFA1301203)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); 쓰촨 대학교 화원 병원 임상 연구 인큐베이션 프로젝트 (22HXFH019); 청두시 과학기술국 국제협력프로젝트(2020-GH02-00017-HZ); 쓰촨성 자연과학재단, 2022NSFSC1314; “1.3.5 우수 분야 프로젝트, 중국 서병원, 쓰촨 대학교”(ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); 및 쓰촨 과학 기술 프로그램(2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O’Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -. C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -. P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -. S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
