Spontan murin modell av anaplastisk sköldkörtelcancer

Summary

Här presenterar vi en standardpipeline för att erhålla murina ATC-tumörer genom spontana genetiskt modifierade musmodeller. Vidare presenterar vi tumördynamik och patologisk information om de primära och metastaserade lesionerna. Denna modell kommer att hjälpa forskare att förstå tumörgenes och underlätta läkemedelsupptäckter.

Abstract

Anaplastisk sköldkörtelcancer (ATC) är en sällsynt men dödlig malignitet med en dyster prognos. Det finns ett akut behov av mer djupgående forskning om cancerframkallande och utveckling av ATC, liksom terapeutiska metoder, eftersom standardbehandlingar i huvudsak är utarmade hos ATC-patienter. Låg prevalens har dock hindrat grundliga kliniska studier och insamling av vävnadsprover, så få framsteg har uppnåtts när det gäller att skapa effektiva behandlingar. Vi använde genteknik för att skapa en villkorligt inducerbar ATC-murin modell (mATC) i en C57BL / 6-bakgrund. ATC-murina modellen genotypades av TPO-cre / ERT2; Braf^CA/WT; Trp53 ex2-10^/ex2-10 och inducerad genom intraperitoneal injektion med tamoxifen. Med murina modellen undersökte vi tumördynamiken (tumörstorleken varierade från 12,4 mm 2 till 32,5 mm² efter 4 månaders induktion), överlevnad (medianöverlevnadsperioden var 130 dagar) och metastaser (lungmetastaser inträffade hos 91,6% av mössen) kurvor och patologiska egenskaper (kännetecknad av Cd8, Foxp3, F4 / 80, Cd206, Ki67 och Caspase-3 immunohistokemisk färgning). Resultaten indikerade att spontan mATC har mycket liknande tumördynamik och immunologisk mikromiljö som humana ATC-tumörer. Sammanfattningsvis, med hög likhet i patofysiologiska egenskaper och enhetliga genotyper, löste mATC-modellen bristen på klinisk ATC-vävnad och provheterogenitet till viss del. Därför skulle det underlätta mekanismen och translationella studier av ATC och ge ett tillvägagångssätt för att undersöka behandlingspotentialen för småmolekylära läkemedel och immunterapimedel för ATC.

Introduction

Sköldkörtelcancer är en av de vanligaste endokrina maligniteterna¹, som härrör från sköldkörtelepitelet. Under de senaste åren har förekomsten av sköldkörtelcancer ökat snabbt över hela världen². Sköldkörtelcancer kan delas in i olika typer beroende på graden av tumörcelldifferentiering. På grundval av kliniskt beteende och histologi är sköldkörtelcancer uppdelad i väldifferentierade karcinom, inklusive papillärt sköldkörtelcancer (PTC) och follikulärt sköldkörtelcancer (FTC), dåligt differentierat karcinom (PDTC) och odifferentierat eller anaplastiskt karcinom i sköldkörteln (ATC)³. I motsats till PTC, som är en vanlig typ med mildt beteende och bättre prognos⁴, är ATC en sällsynt och mycket aggressiv malignitet som står för 2% till 3% av alla sköldkörteltumörer⁵. Även om ATC är sällsynt är det ansvarigt för cirka 50% av sköldkörtelcancerrelaterade dödsfall, med dyster överlevnad (6-8 månader)^6,7. Över 50% av ATC-fallen diagnostiseras som lungmetastaser⁸. Förutom ATC: s aggressiva natur har begränsad effektiv behandling utvecklats i kliniken. Därför har ATC-patienter en dyster prognos 9,10,11. Detta tyder på att ytterligare fördjupade studier är brådskande om de molekylära mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av ATC och behandling.

Tumörgenesen av ATC är en dynamisk dedifferentierad process. Svårigheten att samla humana tumörprover vid varje steg i kliniska studier har hindrat förståelsen av utvecklingsmekanismen från väldifferentierade till odifferentierade karcinom. Däremot gynnar användningen av murina ATC-modeller (mATC) insamlingen av mATC-prover i hela tumörgeneskursen. Därför kan vi bättre förstå mekanismerna för tumörbildning genom att analysera den dynamiska dedifferentierade processen. Dessutom har heterogeniteten hos kliniska ATC-prover också bidragit till svårigheten att förstå den molekylära mekanismen. Ändå delade möss samma genetiska bakgrund och upprätthölls i liknande livsmiljöer, vilket säkerställde varje tumörs konsistens. Detta underlättar att utforska den generaliserade rollen för ATC-utveckling^12,13,14. Dessutom är mATC en in situ-tumörmodell som kan återställa påverkan av den anatomiska platsen och vävnadsspecifika mikromiljön. Som sådan, jämfört med vanliga immunbristfälliga möss, är mATC en spontan murin modell med ett intakt immunsystem och immunmikromiljö.

Därför konstruerade vi villkorligt inducerad mATC med C57BL / 6-stammen, som är en murin modell som kan reproducera de patologiska egenskaperna hos dedifferentierat sköldkörtelcancer. Baserat på denna modell gav vi en kort översikt över den molekylära grunden, konstruktionsidéer, patologiska egenskaper och tillämpningar av mATC. Dessutom observerade och rapporterade vi tumörtillväxt, överlevnadstid, metastaser och patologiska egenskaper hos mATC. Vi tror att detta kommer att vara en informatisk översikt för att hjälpa andra forskare att använda denna modell lättare.

Vi konstruerade en villkorad inducerbar mATC-modell, som först rapporterades av McFadden¹⁵; ursprungligen konstruerade vi möss: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt och Trp53^{flox / wt}. Specifikt inkluderade TPO-cre / ERT2-möss promotorn för humant sköldkörtelperoxidas (TPO) (en sköldkörtelspecifik promotor), som driver uttrycket av en cre-ERT2-fusionsgen (ett cre-rekombinas smält till en human östrogenreceptorligandbindningsdomän). Cre-ERT2 är vanligtvis begränsad till cytoplasman och kommer in i kärnan endast när den utsätts för tamoxifen, vilket inducerar cre att utöva rekombinant enzymaktivitet. När mössen korsas med möss som bär loxP-flankerade sekvenser, efter tamoxifen-induktion, raderar cre-medierad rekombination de floxade sekvenserna i sköldkörtelcellerna för att uppnå syftet att slå ut eller knacka i specifika gener.

Dessutom är Braf ^{flox / wt-möss} en knock-in-allel av human Braf baserat på cre-loxP-systemet. Braf^flox/wt murina transkript kodas av endogena exoner 1-14 och loxP-flankerade humana exoner 15-18. Efter cre-medierad excision av de floxerade regionerna används den muterade exon 15 (modifierad med en V600E-aminosyrasubstitution kopplad till konstitutivt aktiv Braf^V600E i humana cancerformer) och de endogena exoner 16-18 för att generera transkripten. Dessutom är Trp53 ^{flox/wt-möss} knockoutalleler av humant Trp53 och har loxP-platser som flankerar exoner 2-10 av Trp53. När den korsas med möss med en cre-rekombinas, raderar cre-medierad rekombination den floxade sekvensen för att slå ut Trp53. Därefter korsades TPO-cre / ERT2, Braf flox / w och Trp53^{flox / wt} möss för att erhålla TB (TPO-cre^/ ERT2; Braf^flox/wt) möss och TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^flox/wt; Trp53^flox/vikt) möss, som kan användas för att generera PTC och ATC. Efter cirka 8 veckor inducerades mössen genom en intraperitoneal (i.p.) administrering av 150 mg/kg tamoxifen upplöst i majsolja under två administreringar. Tumörtillväxt kunde övervakas med högfrekvent ultraljud (den första tidpunkten för ultraljud registrerades som dag 0). Initialt ultraljud utfördes 40 dagar efter införandet av tamoxifen.

Protocol

De djurförsök som beskrivs här utfördes med godkännande av djuretikkommittén vid West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, Kina. 1. Induktion av TBP-möss Identifiera mössens genotypVid cirka 3 veckor, separera honmössen från hanmössen. Använd samtidigt öronmärkeklämma för att fixa ett öronmärke. Placera öronmärkena i den nedre halvan och på den mellersta tredjedelen av örat, se till att undvika området med den högsta k…

Representative Results

Vi inducerade mATC för att undersöka tumörtillväxt, musöverlevnadstid och patologiska egenskaper. Efter induktion offrades mössen omedelbart och prover (sköldkörtel, lunga och lever) samlades in när ett av följande tillstånd hittades: 1) andningsbesvär orsakad av tumörkompression; 2) minskad aptit och onormal vokalisering; 3) ovanligt slöhet; och 4) viktminskning på över 20%. Under provtagningsprocessen fann vi att alla möss (12/12) framgångsrikt bildade tumörer efter induktion. Vi registrerade musöve…

Discussion

Kritiska steg inom protokollet för dissektion av sköldkörteltumörer
Under dissektion måste sköldkörtelns anatomiska läge förstås korrekt. Sköldkörteln är en fjärilformad körtel belägen på dorsalsidan av den submandibulära körteln nära sköldkörtelbrosket och luftstrupen. Under proceduren undviks noggrant att skära av blodartärerna på båda sidor av halsen.

Modifiering och felsökning av mATC-rasen
ATC är en sällsynt och mycket a…

Materials

100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100