Anaplastik Tiroid Kanserinin Spontan Murin Modeli
Summary
Burada, spontan genetiği değiştirilmiş fare modelleri ile murin ATC tümörleri elde etmek için standart bir boru hattı sunuyoruz. Ayrıca, primer ve metastaz yapmış lezyonlar hakkında tümör dinamikleri ve patolojik bilgiler sunulmuştur. Bu model, araştırmacıların tümörigenezi anlamalarına ve ilaç keşiflerini kolaylaştırmalarına yardımcı olacaktır.
Abstract
Anaplastik tiroid kanseri (ATK) nadir görülen ancak ölümcül bir malignitedir ve kötü prognoza sahiptir. ATC’nin karsinogenezi ve gelişimi ile terapötik yöntemler hakkında daha derinlemesine araştırmalara acil ihtiyaç vardır, çünkü standart tedaviler ATC hastalarında esasen tükenmektedir. Bununla birlikte, düşük prevalansı kapsamlı klinik çalışmaları ve doku örneklerinin toplanmasını engellemiştir, bu nedenle etkili tedavilerin oluşturulmasında çok az ilerleme kaydedilmiştir. C57BL/6 arka planında koşullu olarak indüklenebilir bir ATC murin modeli (mATC) oluşturmak için genetik mühendisliğini kullandık. ATC murin modeli TPO-cre/ERT2 ile genotiplendirildi; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 ve tamoksifen ile intraperitoneal enjeksiyon ile indüklenir. Murin modeli ile tümör dinamikleri (tümör boyutu 4 aylık indüksiyondan sonra 12.4 mm2 ile 32.5mm2 arasında değişmiştir), sağkalım (medyan sağkalım süresi 130 gün idi) ve metastaz (akciğer metastazları farelerin %91.6’sında meydana geldi) eğrilerini ve patolojik özellikleri (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 ve Kaspaz-3 immünohistokimyasal boyama ile karakterize) araştırdık. Sonuçlar, spontan mATC’nin insan ATC tümörlerine oldukça benzer tümör dinamiklerine ve immünolojik mikroçevreye sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, patofizyolojik özellikler ve birleşik genotiplerdeki yüksek benzerlik ile mATC modeli, klinik ATC dokusu ve örnek heterojenitesinin eksikliğini bir dereceye kadar çözmüştür. Bu nedenle, ATK’nın mekanizmasını ve translasyonel çalışmalarını kolaylaştıracak ve ATC için küçük moleküler ilaçların ve immünoterapi ajanlarının tedavi potansiyelini araştırmak için bir yaklaşım sağlayacaktır.
Introduction
Tiroid kanseri, tiroid epiteli kökenini en sık gören endokrin malignitelerden biridir1. Son yıllarda tiroid kanseri insidansı tüm dünyada hızla artmıştır2. Tiroid kanseri, tümör hücresi farklılaşma derecesine göre farklı tiplere ayrılabilir. Klinik davranış ve histoloji temelinde, tiroid karsinomları papiller tiroid karsinomu (PTC) ve foliküler tiroid karsinomu (FTC), kötü diferansiye karsinom (PDTC) ve tiroidin diferansiye edilmemiş veya anaplastik karsinomu (ATC)3 dahil olmak üzere iyi diferansiye karsinomlara ayrılır. Hafif davranışlı ve daha iyi prognozlu4 yaygın bir tip olan PTC’nin aksine, ATC tüm tiroid tümörlerinin %2 ila %3’ünü oluşturan, nadir ve oldukça agresif bir malignitedir5. ATK nadir olmasına rağmen, tiroid kanserine bağlı ölümlerin yaklaşık %50’sinden sorumludur ve kasvetli sağkalım (6-8 ay)6,7. ATC olgularının %50’sinden fazlası akciğer metastazı 8 olarak teşhisedilir. ATC’nin agresif doğasına ek olarak, klinikte sınırlı etkili tedavi geliştirilmiştir. Bu nedenle ATC hastalarının kasvetli prognozu 9,10,11’dir. Bu, ATK’nın gelişiminin ve tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında acilen daha derinlemesine çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
ATC’nin tümörigenezi dinamik bir farklılaşmamış süreçtir. Klinik çalışmaların her aşamasında insan tümör örneklerinin toplanmasındaki zorluk, iyi diferansiye karsinomlardan farklılaşmamış karsinomlara kadar gelişim mekanizmasının anlaşılmasını engellemiştir. Buna karşılık, murin ATC modellerinin (mATC) kullanımı, tüm tümörigenez seyrinde mATC örneklerinin toplanmasını desteklemektedir. Bu nedenle, dinamik farklılaşmamış süreci analiz ederek tümör oluşum mekanizmalarını daha iyi anlayabiliriz. Ek olarak, klinik ATC örneklerinin heterojenliği de moleküler mekanizmanın anlaşılmasındaki zorluğa katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, fareler aynı genetik geçmişleri paylaştılar ve benzer yaşam ortamlarında tutuldular ve her tümörün tutarlılığını sağladılar. Bu, ATC gelişiminin genelleştirilmiş rolünü keşfetmeyi kolaylaştırır12,13,14. Ek olarak, mATC, anatomik lokalizasyonun ve dokuya özgü mikro çevrenin etkisini geri kazanabilen in situ bir tümör modelidir. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılan immün yetmezlikli farelerle karşılaştırıldığında, mATC, sağlam bir bağışıklık sistemi ve bağışıklık mikroçevresi olan spontan bir murin modelidir.
Bu nedenle, dediferansiye tiroid karsinomunun patolojik özelliklerini yeniden üretebilen bir murin modeli olan C57BL/6 suşu ile şartlı olarak indüklenen mATC oluşturduk. Bu modele dayanarak, mATC’nin moleküler temeli, yapım fikirleri, patolojik özellikleri ve uygulamaları hakkında kısa bir genel bakış sunduk. Ayrıca tümör büyümesini, sağkalım süresini, metastazını ve mATC’nin patolojik özelliklerini gözlemledik ve raporladık. Bunun, diğer araştırmacıların bu modeli daha kolay kullanmalarına yardımcı olmak için bilgilendirici bir genel bakış olacağına inanıyoruz.
İlk olarak McFadden15 tarafından bildirildiği gibi koşullu indüklenebilir bir mATC modeli oluşturduk; Başlangıçta, fareler inşa ettik: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt ve Trp53flox / wt. Spesifik olarak, TPO-cre / ERT2 fareleri, bir cre-ERT2 füzyon geninin (bir insan östrojen reseptörü ligand bağlanma alanına kaynaşmış bir cre rekombinaz) ekspresyonunu yönlendiren insan tiroid peroksidaz (TPO) promotörünü (tiroide özgü bir promotör) içeriyordu. Cre-ERT2 genellikle sitoplazma ile sınırlıdır ve çekirdeğe sadece tamoksifene maruz kaldığında girer, bu da cre’yi rekombinant enzim aktivitesi göstermeye teşvik eder. Fareler, loxP kanatlı sekanslar taşıyan farelerle çaprazlandığında, tamoksifen indüksiyonundan sonra, kre aracılı rekombinasyon, spesifik genlerde nakavt veya nakavt etme amacına ulaşmak için tiroid hücrelerindeki flokslu dizileri siler.
Ek olarak, Braf flox / wt fareleri, cre-loxP sistemine dayanan insan Braf’ın bir knock-in aleli. Brafflox / wt murin transkripti, endojen ekzonlar 1-14 ve loxP kanatlı insan ekzonları 15-18 tarafından kodlanır. Flokslu bölgelerin kreasyona aracılı eksizyonundan sonra, mutant ekzon 15 (insan kanserlerinde yapısal olarak aktif Braf V600E ile bağlantılı birV600E amino asit ikamesi ile modifiye edilmiş) ve endojen ekzonlar 16-18 transkriptleri oluşturmak için kullanılır. Ayrıca, Trp53 flox / wt fareleri, insan Trp53’ün nakavt alelleridir ve Trp53’ün ekzonları 2-10’u çevreleyen loxP bölgelerine sahiptir. Bir cre rekombinaz ile farelerle çaprazlandığında, cre-mediated rekombinasyon, Trp53’ü nakavt etmek için flokslu diziyi siler. Daha sonra, TB elde etmek için TPO-cre / ERT2, Braf flox / w ve Trp53flox / wt fareleri çaprazlandı (TPO-cre/ ERT2; Braffloks/wt) fareler ve TBP (TPO-cre/ERT2; Braffloks/ağırlık; Trp53floks/ağırlık) PTC ve ATC üretmek için kullanılabilecek fareler. Yaklaşık 8 hafta sonra, fareler, iki uygulama için mısır yağında çözünmüş 150 mg / kg tamoksifenin intraperitoneal (i.p.) uygulaması ile indüklendi. Tümör büyümesi yüksek frekanslı ultrasonografi ile izlenebilir (ultrasonografinin ilk zaman noktası Gün 0 olarak kaydedildi). İlk ultrasonografi tamoksifen girişinden 40 gün sonra yapıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tiroid tümörü diseksiyonu için protokol dahilinde kritik adımlar
Diseksiyon sırasında, tiroid bezinin anatomik yerinin doğru anlaşılması gerekir. Tiroid bezi, submandibuler bezin dorsal tarafında, tiroid kıkırdağı ve trakeaya yakın bir yerde bulunan kelebek şeklinde bir bezdir. İşlem sırasında, boynun her iki tarafındaki kan arterlerinin kesilmesinden dikkatlice kaçınıldı.
mATC ırkının değiştirilmesi ve sorun giderilmesi
A…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma Geliştirme Programı (2021YFA1301203) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); Klinik Araştırma Kuluçka Projesi, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (22HXFH019); Chengdu Belediyesi Bilim ve Teknoloji Bürosu Uluslararası İşbirliği Projesi (2020-GH02-00017-HZ); Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı, 2022NSFSC1314; “1.3.5 mükemmellik disiplinleri projesi, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi” (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O’Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -. C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -. P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -. S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
