丁香假单胞菌基因在植物组织中表达的单细胞分析
Summary
本协议描述了一种方法，该方法允许对植物质外体内生长的丁 香假单胞菌 种群进行单细胞基因表达分析。
Abstract
大量的病原微生物不断攻击植物。 丁香假单胞 菌物种复合体包括与多种宿主特别相关的革兰氏阴性植物致病菌。 丁香假单胞 菌从叶表面进入植物，并在质外体内迅速繁殖，形成占据细胞间隙的微菌落。细菌对荧光蛋白的组成性表达允许微菌落的可视化和在微观水平上监测感染的发展。单细胞分析的最新进展揭示了克隆同基因细菌群体所达到的巨大复杂性。这种复杂性被称为表型异质性，是细菌群落之间基因表达的细胞间差异（与遗传差异无关）的结果。为了在单细胞水平上分析单个位点的表达，荧光蛋白的转录融合已被广泛使用。在胁迫条件下，例如在植物质外体定植期间发生的条件， 丁香假单胞菌 根据关键毒力基因（即 Hrp III 型分泌系统）的异质表达分化为不同的亚群。然而，由于接种和细菌提取过程中固有的机械破坏过程中释放的细胞碎片，因此对从植物组织回收的任何给定丁 香假单胞菌 种群的单细胞分析具有挑战性。本报告详细介绍了一种在拟南芥和豆类植物定植期间在单细胞水平上监测感兴趣的 丁香假单胞菌 基因表达的方法。描述了植物的制备和用于使用真空室接种的细菌悬浮液。这里还解释了通过质外体液提取从感染叶片中回收内生细菌的方法。细菌接种和细菌提取方法均经过经验优化，以最大限度地减少植物和细菌细胞损伤，从而产生最适合显微镜和流式细胞术分析的细菌制剂。
Introduction
致病菌在不同表型中表现出差异，导致在基因相同的种群中形成亚群。这种现象被称为表型异质性，并已被提出作为细菌-宿主相互作用期间的适应策略1。共聚焦显微镜、流式细胞术和微流体的光学分辨率与荧光蛋白相结合的最新进展促进了细菌种群的单细胞分析2。
革兰氏阴性丁香假单胞菌是一种原型植物致病菌，由于其学术和经济重要性3。丁香假单胞菌的生命周期与水循环4有关。丁香假单胞菌通过气孔或伤口等自然孔径进入叶肉细胞之间的细胞间空间，即植物叶质外体5。一旦进入质外体，丁香假单胞菌依靠III型分泌系统（T3SS）和III型易位效应器（T3E）来抑制植物免疫并操纵植物细胞功能以造福病原体6。T3SS和T3E的表达取决于主调节因子HrpL，这是一种与靶基因7启动子区域中hrp盒基序结合的替代西格玛因子。
通过产生与目的基因下游荧光蛋白基因的染色体定位转录融合，可以根据单细胞水平8发射的荧光水平监测基因表达。使用这种方法，已经确定 hrpL 的表达在实验室中生长的细菌培养物和从植物质外体8，9中回收的细菌种群中都是异质的。虽然单细胞水平的基因表达分析通常在实验室培养基中生长的细菌培养物中进行，但这种分析也可以对植物内生长的细菌种群进行，从而为自然环境中亚群的形成提供有价值的信息。分析从植物中提取的细菌种群的潜在限制是，经典的接种方法通过注射器压力浸润到质外体中，然后通过浸渍叶组织进行细菌提取，通常会产生大量干扰下游分析的细胞植物碎片10。大多数细胞碎片由叶绿体的自发荧光片段组成，这些片段与GFP荧光重叠，导致误导性结果。
本协议描述了分析两个模型病理系统中单细胞基因表达异质性的过程：由 丁香假单胞菌 pv形成的病理系统。番茄菌株DC3000和 拟南芥 （Col-0），另一种由 丁香假单胞 菌PV组成。菜豆菌株1448A和豆类植物（菜豆 品种加拿大奇迹）。提出了一种基于真空渗透的接种方法，利用真空室和泵，形成了一种快速、无损的全叶浸润方法。此外，作为对传统方案的改进，使用一种更温和的方法从质外体中提取细菌群，从而显着减少组织破坏，基于通过在注射器内使用少量体积施加正压和负压循环来提取质外体液。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的方法描述了一种非侵入性程序，它允许细菌渗透到植物叶面组织中，允许快速接种大量，同时最大限度地减少组织破坏。 丁香假单胞菌 物种复合体的特征之一是能够在植物质外体内和植物表面作为附生植物14存活和增殖。因此，不能排除使用本协议提取的细菌仅来自植物质外体的可能性。然而，以前使用共聚焦显微镜证明，与植物叶片内的细菌生长相比，叶子…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了由MCIN/AEI/10.13039/501100011033/资助的项目赠款RTI2018-095069-B-I00和“ERDP创造欧洲的方式”的支持。J.S.R.由安达卢兹调查、发展和创新计划（PAIDI 2020）资助。NLP由安达卢兹调查、发展和创新计划的P18-RT-2398项目资助。
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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