Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, die eine Einzelzell-Genexpressionsanalyse an Pseudomonas syringae-Populationen ermöglicht, die innerhalb des Pflanzenapoplasten gezüchtet werden.
Abstract
Eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen greift ständig Pflanzen an. Der Artenkomplex von Pseudomonas syringae umfasst gramnegative pflanzenpathogene Bakterien, die für eine Vielzahl von Wirten von besonderer Bedeutung sind. P. syringae dringt von der Blattoberfläche in die Pflanze ein und vermehrt sich schnell innerhalb des Apoplasten, wobei Mikrokolonien gebildet werden, die den Interzellularraum einnehmen. Die konstitutive Expression von fluoreszierenden Proteinen durch die Bakterien ermöglicht die Visualisierung der Mikrokolonien und die Überwachung der Entwicklung der Infektion auf mikroskopischer Ebene. Jüngste Fortschritte in der Einzelzellanalyse haben die große Komplexität klonaler isogener Bakterienpopulationen aufgezeigt. Diese Komplexität, die als phänotypische Heterogenität bezeichnet wird, ist die Folge von Zell-zu-Zell-Unterschieden in der Genexpression (die nicht mit genetischen Unterschieden verbunden sind) in der Bakteriengemeinschaft. Um die Expression einzelner Loci auf Einzelzellebene zu analysieren, sind transkriptionelle Fusionen mit fluoreszierenden Proteinen weit verbreitet. Unter Stressbedingungen, wie sie bei der Besiedlung des Pflanzenapoplasten auftreten, differenziert sich P. syringae aufgrund der heterogenen Expression wichtiger Virulenzgene (d.h. des Hrp-Typ-III-Sekretionssystems) in unterschiedliche Subpopulationen. Die Einzelzellanalyse einer bestimmten P. syringae-Population , die aus Pflanzengewebe gewonnen wurde, ist jedoch aufgrund der Zelltrümmer, die während der mechanischen Störung freigesetzt werden, die den Inokulations- und Bakterienextraktionsprozessen innewohnt, eine Herausforderung. Der vorliegende Bericht beschreibt eine Methode, die entwickelt wurde, um die Expression von P. syringae-Genen von Interesse auf Einzelzellebene während der Besiedlung von Arabidopsis und Bohnenpflanzen zu überwachen. Die Herstellung der Pflanzen und die zur Inokulation verwendeten Bakteriensuspensionen unter Verwendung einer Vakuumkammer werden beschrieben. Hier wird auch die Rückgewinnung von endophytischen Bakterien aus infizierten Blättern durch apoplastische Flüssigkeitsextraktion erläutert. Sowohl die bakterielle Inokulation als auch die bakterielle Extraktionsmethode sind empirisch optimiert, um die Schädigung von Pflanzen- und Bakterienzellen zu minimieren, was zu bakteriellen Präparaten führt, die für die Mikroskopie und Durchflusszytometrieanalyse optimal sind.
Introduction
Pathogene Bakterien weisen Unterschiede in verschiedenen Phänotypen auf, was zur Bildung von Subpopulationen innerhalb genetisch identischer Populationen führt. Dieses Phänomen wird als phänotypische Heterogenität bezeichnet und wurde als Anpassungsstrategie während der Bakterien-Wirt-Interaktionen vorgeschlagen1. Jüngste Fortschritte in der optischen Auflösung von konfokalen Mikroskopen, Durchflusszytometrie und Mikrofluidik in Kombination mit fluoreszierenden Proteinen haben Einzelzellanalysen von Bakterienpopulationen gefördert2.
Der gramnegative Pseudomonas syringae ist aufgrund seiner akademischen und wirtschaftlichen Bedeutung ein archetypisches pflanzenpathogenes Bakterium3. Der Lebenszyklus von P. syringae ist mit dem Wasserkreislaufverbunden 4. P. syringae dringt durch natürliche Öffnungen wie Stomata oder Wunden in die Interzellularräume zwischen den Mesophyllzellen, dem Pflanzenblattapoplasten, ein5. Im Apoplast verlässt sich P. syringae auf das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) und die Typ-III-translozierten Effektoren (T3E), um die pflanzliche Immunität zu unterdrücken und pflanzliche Zellfunktionen zum Wohle des Erregers zu manipulieren6. Die Expression von T3SS und T3E hängt vom Hauptregulator HrpL ab, einem alternativen Sigma-Faktor, der an die hrp-Box-Motive in der Promotorregion der Zielgene7 bindet.
Durch die Erzeugung chromosomenlokaler transkriptioneller Fusionen mit fluoreszierenden Proteingenen stromabwärts des interessierenden Gens kann man die Genexpression basierend auf den Fluoreszenzniveaus überwachen, die auf Einzelzellebene emittiert werden8. Mit dieser Methode wurde festgestellt, dass die Expression von hrpL sowohl innerhalb von Bakterienkulturen, die im Labor gezüchtet wurden, als auch innerhalb von Bakterienpopulationen, die aus dem Pflanzenapoplasten 8,9 gewonnen wurden, heterogen ist. Obwohl Genexpressionsanalysen auf Einzelzellebene typischerweise in Bakterienkulturen durchgeführt werden, die in Labormedien gezüchtet werden, können solche Analysen auch an Bakterienpopulationen durchgeführt werden, die in der Pflanze wachsen, und liefern so wertvolle Informationen über die Bildung von Subpopulationen im natürlichen Kontext. Eine mögliche Einschränkung für die Analyse von Bakterienpopulationen, die aus der Pflanze extrahiert werden, besteht darin, dass klassische Inokulationsmethoden durch Spritzendruckinfiltration in den Apoplasten, gefolgt von einer bakteriellen Extraktion durch Mazeration des Blattgewebes, typischerweise eine große Menge zellulärer Pflanzenreste erzeugen, die die nachgeschaltete Analyse stören10. Die meisten Zelltrümmer bestehen aus autofluoreszierenden Fragmenten von Chloroplasten, die sich mit der GFP-Fluoreszenz überlappen, was zu irreführenden Ergebnissen führt.
Das vorliegende Protokoll beschreibt den Prozess der Analyse der Heterogenität der Einzelzell-Genexpression in zwei Modell-Pathosystemen: dem von der P. syringae pv. Tomatenstamm DC3000 und Arabidopsis thaliana (Col-0), und der andere durch die P. syringae pv. Phaseolicola-Stamm 1448A und Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris-Sorte , Canadian Wonder). Es wird eine Inokulationsmethode vorgeschlagen, die auf einer Vakuuminfiltration unter Verwendung einer Vakuumkammer und einer Pumpe basiert, was zu einer schnellen und schadensfreien Methode zum Infiltrieren ganzer Blätter führt. Darüber hinaus wird als Verbesserung gegenüber herkömmlichen Protokollen eine schonendere Methode verwendet, um die Bakterienpopulation aus dem Apoplasten zu extrahieren, die die Gewebezerstörung signifikant reduziert, basierend auf der Extraktion von apoplastischer Flüssigkeit durch Anlegen von Über- und Unterdruckzyklen mit einer kleinen Menge Volumen innerhalb einer Spritze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Methode beschreibt ein nicht-invasives Verfahren, das die Infiltration von Bakterien in das pflanzliche Blattgewebe ermöglicht und so die schnelle Inokulation großer Volumina bei gleichzeitiger Minimierung des Gewebeaufschlusses ermöglicht. Eines der Merkmale des P. syringae-Artenkomplexes ist die Fähigkeit, im Pflanzenapoplasten und auf der Pflanzenoberfläche als Epiphyt14 zu überleben und sich zu vermehren. Somit kann nicht ausgeschlossen werden, dass die unt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Projektzuschuss RTI2018-095069-B-I00 unterstützt, der von MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ finanziert wurde, und durch “ERDP A way of making Europe”. J.S.R. wurde durch den Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020) finanziert. N.L.P. wurde durch den Projektzuschuss P18-RT-2398 von Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación finanziert.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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