पौधे के ऊतक के भीतर स्यूडोमोनास सिरिंगे जीन की अभिव्यक्ति का एकल-कोशिका विश्लेषण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो पौधे के एपोप्लास्ट के भीतर उगाए गए स्यूडोमोनास सिरिंगे आबादी पर एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
रोगजनक सूक्ष्मजीवों की अधिकता लगातार पौधों पर हमला करती है। स्यूडोमोनास सिरिंगे प्रजाति परिसर में मेजबानों की एक विस्तृत संख्या के लिए विशेष प्रासंगिकता के ग्राम-नकारात्मक पौधे-रोगजनक बैक्टीरिया शामिल हैं। सिरिंगे पत्ती की सतह से पौधे में प्रवेश करता है और एपोप्लास्ट के भीतर तेजी से बढ़ता है, जिससे माइक्रोकलोनियां बनती हैं जो अंतरकोशिकीय स्थान पर कब्जा कर लेती हैं। बैक्टीरिया द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति सूक्ष्म उपनिवेशों के विज़ुअलाइज़ेशन और सूक्ष्म स्तर पर संक्रमण के विकास की निगरानी की अनुमति देती है। एकल-कोशिका विश्लेषण में हालिया प्रगति ने क्लोनल इसोजेनिक जीवाणु आबादी द्वारा पहुंचने वाली बड़ी जटिलता का खुलासा किया है। यह जटिलता, जिसे फेनोटाइपिक विषमता के रूप में जाना जाता है, बैक्टीरिया समुदाय के बीच जीन अभिव्यक्ति (आनुवंशिक अंतर से जुड़ा नहीं) में सेल-टू-सेल अंतर का परिणाम है। एकल-कोशिका स्तर पर व्यक्तिगत लोकी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ट्रांसक्रिप्शनल संलयन का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। तनाव की स्थिति में, जैसे कि पौधे के एपोप्लास्ट के औपनिवेशीकरण के दौरान होने वाली, पी सिरिंगे प्रमुख विषाणु जीन (यानी, एचआरपी टाइप III स्राव प्रणाली) की विषम अभिव्यक्ति के आधार पर अलग-अलग उप-आबादी में अंतर करता है। हालांकि, पौधे के ऊतकों से बरामद किसी भी पी सिरिंगे आबादी का एकल-कोशिका विश्लेषण टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए आंतरिक यांत्रिक व्यवधान के दौरान जारी सेलुलर मलबे के कारण चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान रिपोर्ट में एराबिडोप्सिस और बीन पौधों के उपनिवेशीकरण के दौरान एकल-कोशिका स्तर पर रुचि के पी सिरिंगे जीन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए विकसित एक विधि का विवरण दिया गया है। वैक्यूम कक्ष का उपयोग करके टीकाकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधों की तैयारी और जीवाणु निलंबन का वर्णन किया गया है। एपोप्लास्टिक द्रव निष्कर्षण द्वारा संक्रमित पत्तियों से एंडोफाइटिक बैक्टीरिया की वसूली भी यहां बताई गई है। बैक्टीरियल टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण विधियों दोनों को पौधे और जीवाणु कोशिका क्षति को कम करने के लिए अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए इष्टतम जीवाणु तैयारी होती है।
Introduction
रोगजनक बैक्टीरिया विभिन्न फेनोटाइप्स में अंतर प्रदर्शित करते हैं, जिससे आनुवंशिक रूप से समान आबादी के भीतर उप-आबादी के गठन को जन्म मिलता है। इस घटना को फेनोटाइपिक विषमता के रूप में जाना जाता है और इसे बैक्टीरिया-होस्ट इंटरैक्शन 1 के दौरान अनुकूलन रणनीतिके रूप में प्रस्तावित किया गया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संयुक्त कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोफ्लुइडिक्स के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन में हालिया प्रगति ने बैक्टीरिया की आबादी के एकल-सेल विश्लेषण को बढ़ावा दियाहै।
ग्राम-नकारात्मक स्यूडोमोनास सिरिंगे अपने अकादमिक औरआर्थिक महत्व दोनों के कारण एक पुरातन पौधे रोगजनक बैक्टीरिया है। पी सिरिंगे का जीवन चक्र जल चक्र4 से जुड़ा हुआ है। सिरिंगे मेसोफिल कोशिकाओं, पौधे की पत्ती एपोप्लास्ट के बीच अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में प्रवेश करता है, प्राकृतिक एपर्चर जैसे स्टोमेटा या घाव5 के माध्यम से। एक बार एपोप्लास्ट के भीतर, पी सिरिंगे पौधे की प्रतिरक्षा को दबाने और रोगज़नक़6 के लाभ के लिए पौधे सेलुलर कार्यों में हेरफेर करने के लिए टाइप III स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) और टाइप III-ट्रांसलोकेटेड प्रभावकों (टी 3 ई) पर निर्भर करता है। टी 3 एसएस और टी 3 ई की अभिव्यक्ति मास्टर नियामक एचआरपीएल पर निर्भर करती है, एक वैकल्पिक सिग्मा कारक जो लक्ष्य जीन 7 के प्रमोटर क्षेत्र में एचआरपी-बॉक्स रूपांकनों को बांधताहै।
रुचि के जीन के डाउनस्ट्रीम फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के लिए क्रोमोसोम-स्थित ट्रांसक्रिप्शनल संलयन उत्पन्न करके, कोई एकल-कोशिका स्तर8 पर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति स्तरों के आधार पर जीन अभिव्यक्ति की निगरानी कर सकता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, यह स्थापित किया गया है कि एचआरपीएल की अभिव्यक्ति प्रयोगशाला में उगाई गई जीवाणु संस्कृतियों के भीतर और पौधे एपोप्लास्ट 8,9 से बरामद जीवाणु आबादी के भीतर विषम है। यद्यपि एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण आमतौर पर प्रयोगशाला मीडिया में उगाए गए जीवाणु संस्कृतियों में किया जाता है, इस तरह के विश्लेषण पौधे के भीतर बढ़ने वाली जीवाणु आबादी पर भी किए जा सकते हैं, इस प्रकार प्राकृतिक संदर्भ में उप-आबादी के गठन पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं। पौधे से निकाली गई जीवाणु आबादी के विश्लेषण के लिए एक संभावित सीमा यह है कि एपोप्लास्ट में सिरिंज-दबाव घुसपैठ द्वारा क्लासिक टीकाकरण विधियां, इसके बाद पत्ती के ऊतकों के मैकेशन द्वारा जीवाणु निष्कर्षण, आमतौर पर बड़ी मात्रा में सेलुलर पौधे के मलबे उत्पन्न करता है जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण10 में हस्तक्षेप करता है। अधिकांश सेलुलर मलबे में क्लोरोप्लास्ट के ऑटोफ्लोरोसेंट टुकड़े होते हैं जो जीएफपी प्रतिदीप्ति के साथ ओवरलैप होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप भ्रामक परिणाम होते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल दो मॉडल पैथोसिस्टम में एकल-सेल जीन अभिव्यक्ति विषमता का विश्लेषण करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है: पी सिरिंगे पीवी द्वारा गठित एक। टमाटर स्ट्रेन डीसी 3000 और एराबिडोप्सिस थैलियाना (कोल -0), और दूसरा पी सिरिंगे पीवी द्वारा। फेजोलिकोला स्ट्रेन 1448 ए और बीन पौधे (फेजोलस वल्गारिस कल्टीवेटर कैनेडियन वंडर)। वैक्यूम चैंबर और पंप का उपयोग करके वैक्यूम घुसपैठ के आधार पर एक टीकाकरण विधि प्रस्तावित की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप पूरी पत्तियों में घुसपैठ करने के लिए एक तेज और क्षति मुक्त विधि होती है। इसके अलावा, पारंपरिक प्रोटोकॉल पर सुधार के रूप में, एपोप्लास्ट से बैक्टीरिया की आबादी को निकालने के लिए एक सौम्य विधि का उपयोग किया जाता है जो एक सिरिंज के भीतर मात्रा की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के चक्रों को लागू करके एपोप्लास्टिक द्रव के निष्कर्षण के आधार पर ऊतक व्यवधान को काफी कम करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विधि एक गैर-इनवेसिव प्रक्रिया का वर्णन करती है जो पौधे के पर्ण ऊतक में बैक्टीरिया की घुसपैठ की अनुमति देती है, जिससे ऊतक व्यवधान को कम करते हुए बड़ी मात्रा में तेजी से टीकाकरण की अनुमति मि…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ और “ERDP को यूरोप बनाने का एक तरीका” द्वारा वित्त पोषित प्रोजेक्ट ग्रांट RTI2018-095069-B-I00 द्वारा समर्थित किया गया था। जेएसआर को प्लान एंडालुज़ डी इन्वेस्टिगासिओन, डेसररोलो ई इनोवैसिओन (पेडी 2020) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनएलपी को प्रोजेक्ट ग्रांट पी 18-आरटी -2398 द्वारा प्लान एंडालुज़ डी इन्वेस्टिगासियोन, डेसररोलो ई इनोवासियोन से वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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