Analisi unicellulare dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae all'interno del tessuto vegetale
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo che consente l’analisi dell’espressione genica unicellulare su popolazioni di Pseudomonas syringae coltivate all’interno dell’apoplasto della pianta.
Abstract
Una pletora di microrganismi patogeni attacca costantemente le piante. Il complesso di specie Pseudomonas syringae comprende batteri patogeni delle piante Gram-negativi di particolare rilevanza per un ampio numero di ospiti. P. syringae entra nella pianta dalla superficie fogliare e si moltiplica rapidamente all’interno dell’apoplasto, formando microcolonie che occupano lo spazio intercellulare. L’espressione costitutiva delle proteine fluorescenti da parte dei batteri consente la visualizzazione delle microcolonie e il monitoraggio dello sviluppo dell’infezione a livello microscopico. I recenti progressi nell’analisi di singole cellule hanno rivelato la grande complessità raggiunta dalle popolazioni batteriche isogeniche clonali. Questa complessità, indicata come eterogeneità fenotipica, è la conseguenza delle differenze cellula-cellula nell’espressione genica (non legate a differenze genetiche) tra la comunità batterica. Per analizzare l’espressione dei singoli loci a livello di singola cellula, sono state ampiamente utilizzate fusioni trascrizionali in proteine fluorescenti. In condizioni di stress, come quelle che si verificano durante la colonizzazione dell’apoplasto della pianta, P. syringae si differenzia in sottopopolazioni distinte in base all’espressione eterogenea di geni chiave di virulenza (cioè il sistema di secrezione di tipo III Hrp). Tuttavia, l’analisi a singola cellula di una determinata popolazione di P. syringae recuperata dal tessuto vegetale è impegnativa a causa dei detriti cellulari rilasciati durante l’interruzione meccanica intrinseca ai processi di inoculazione ed estrazione batterica. Il presente rapporto descrive un metodo sviluppato per monitorare l’espressione dei geni P. syringae di interesse a livello di singola cellula durante la colonizzazione di piante di Arabidopsis e fagioli. Vengono descritte la preparazione delle piante e le sospensioni batteriche utilizzate per l’inoculazione mediante camera a vuoto. Qui viene spiegato anche il recupero dei batteri endofiti dalle foglie infette mediante estrazione di liquido apoplastico. Sia l’inoculazione batterica che i metodi di estrazione batterica sono ottimizzati empiricamente per ridurre al minimo il danno alle cellule vegetali e batteriche, risultando in preparati batterici ottimali per la microscopia e l’analisi della citometria a flusso.
Introduction
I batteri patogeni mostrano differenze nei diversi fenotipi, dando origine alla formazione di sottopopolazioni all’interno di popolazioni geneticamente identiche. Questo fenomeno è noto come eterogeneità fenotipica ed è stato proposto come strategia di adattamento durante le interazioni batterio-ospite1. I recenti progressi nella risoluzione ottica dei microscopi confocali, della citometria a flusso e della microfluidica, combinati con proteine fluorescenti, hanno favorito l’analisi a singola cellula delle popolazioni batteriche2.
La Pseudomonas syringae Gram-negativa è un batterio patogeno delle piante archetipico a causa della sua importanza sia accademica che economica3. Il ciclo vitale di P. syringae è legato al ciclo dell’acqua4. P. syringae entra negli spazi intercellulari tra le cellule del mesofillo, la foglia della pianta apoplasta, attraverso aperture naturali come stomi o ferite5. Una volta all’interno dell’apoplasto, P. syringae si basa sul sistema di secrezione di tipo III (T3SS) e sugli effettori traslocati di tipo III (T3E) per sopprimere l’immunità delle piante e manipolare le funzioni cellulari delle piante a beneficio del patogeno6. L’espressione di T3SS e T3E dipende dal regolatore principale HrpL, un fattore sigma alternativo che si lega ai motivi hrp-box nella regione del promotore dei geni bersaglio7.
Generando fusioni trascrizionali localizzate dal cromosoma a geni proteici fluorescenti a valle del gene di interesse, è possibile monitorare l’espressione genica in base ai livelli di fluorescenza emessia livello 8 di singola cellula. Utilizzando questo metodo, è stato stabilito che l’espressione di hrpL è eterogenea sia all’interno di colture batteriche coltivate in laboratorio che all’interno di popolazioni batteriche recuperate dalla pianta apoplast 8,9. Sebbene l’analisi dell’espressione genica a livello monocellulare sia tipicamente eseguita in colture batteriche coltivate in terreni di laboratorio, tali analisi possono essere effettuate anche su popolazioni batteriche che crescono all’interno della pianta, fornendo così preziose informazioni sulla formazione di sottopopolazioni nel contesto naturale. Un potenziale limite per l’analisi delle popolazioni batteriche estratte dalla pianta è che i metodi classici di inoculazione mediante infiltrazione a pressione della siringa nell’apoplast, seguita dall’estrazione batterica mediante macerazione del tessuto fogliare, generano tipicamente una grande quantità di detriti vegetali cellulari che interferiscono con l’analisi a valle10. La maggior parte dei detriti cellulari è costituita da frammenti autofluorescenti di cloroplasti che si sovrappongono alla fluorescenza GFP, con risultati fuorvianti.
Il presente protocollo descrive il processo di analisi dell’eterogeneità dell’espressione genica di singole cellule in due patosistemi modello: quello formato da P. syringae pv. ceppo di pomodoro DC3000 e Arabidopsis thaliana (Col-0), e l’altro dal P. syringae pv. phaseolicola ceppo 1448A e piante di fagioli (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Viene proposto un metodo di inoculazione basato sull’infiltrazione sotto vuoto utilizzando una camera a vuoto e una pompa, risultando in un metodo rapido e privo di danni per infiltrarsi nelle foglie intere. Inoltre, come miglioramento rispetto ai protocolli convenzionali, viene utilizzato un metodo più delicato per estrarre la popolazione batterica dall’apoplast che riduce significativamente la rottura dei tessuti, basato sull’estrazione del liquido apoplastico applicando cicli di pressione positiva e negativa utilizzando una piccola quantità di volume all’interno di una siringa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato descrive una procedura non invasiva che consente l’infiltrazione di batteri nel tessuto fogliare vegetale, consentendo la rapida inoculazione di grandi volumi riducendo al minimo la distruzione del tessuto. Una delle caratteristiche del complesso di specie P. syringae è la capacità di sopravvivere e proliferare all’interno dell’apoplast della pianta e sulla superficie della pianta come epifita14. Pertanto, non si può escludere la possibilità che i batteri estr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Project Grant RTI2018-095069-B-I00 finanziato da MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ e da “ERDP A way of making Europe”. J.S.R. è stato finanziato da Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. è stato finanziato dal Project Grant P18-RT-2398 di Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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