植物組織における シュードモナス・シリンガエ 遺伝子発現の単一細胞解析
Summary
本プロトコルは、植物アポプラスト内で増殖した シュードモナス・シリンガエ 集団の単一細胞遺伝子発現解析を可能にする方法を記載する。
Abstract
多数の病原性微生物が絶えず植物を攻撃しています。 シュードモナス・シリンガエ 種複合体は、多数の宿主に特に関連するグラム陰性植物病原性細菌を包含する。 P. syringae は葉の表面から植物に入り、アポプラスト内で急速に増殖し、細胞間空間を占める微小コロニーを形成します。細菌による蛍光タンパク質の構成的発現は、微小コロニーの可視化および顕微鏡レベルでの感染の発生のモニタリングを可能にする。シングルセル解析の最近の進歩により、クローン同質遺伝子細菌集団が到達する大きな複雑さが明らかになりました。表現型の不均一性と呼ばれるこの複雑さは、細菌群集間の遺伝子発現の細胞間の違い(遺伝的差異とは関連していない)の結果です。個々の遺伝子座の発現を単一細胞レベルで解析するために、蛍光タンパク質への転写融合が広く用いられている。植物アポプラストのコロニー形成中に発生するようなストレス条件下では、 P. syringae は、主要な病原性遺伝子(すなわち、HrpタイプIII分泌系)の不均一な発現に基づいて、異なる亜集団に分化します。しかし、植物組織から回収された P. syringae 集団の単一細胞分析は、接種および細菌抽出プロセスに固有の機械的破壊中に放出される細胞破片のために困難です。本報告では、シロイヌナズナとマメのコロニー形成中に関心のある P. syringae 遺伝子の発現を単一細胞レベルでモニタリングするために開発された方法について詳述する。真空チャンバーを用いた接種に使用される植物および細菌懸濁液の調製について説明する。アポプラスチック流体抽出による感染葉からの内生細菌の回収についてもここで説明します。細菌接種法と細菌抽出法の両方が、植物および細菌細胞の損傷を最小限に抑えるように経験的に最適化されているため、顕微鏡検査およびフローサイトメトリー分析に最適な細菌調製物が得られます。
Introduction
病原性細菌は多様な表現型に違いを示し、遺伝的に同一の集団内に亜集団の形成を引き起こします。この現象は表現型不均一性として知られており、細菌と宿主の相互作用における適応戦略として提案されています1。共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、マイクロフルイディクスの光学分解能の最近の進歩は、蛍光タンパク質と組み合わせて、細菌集団の単一細胞分析を促進しました2。
グラム陰性 シュードモナス・シリンガエ は、その学術的および経済的重要性の両方のために、典型的な植物病原菌です3。 P. syringae の生活環は水循環4と関連している。 P. syringae は、葉肉細胞間の細胞間空間に入り、植物の葉アポプラスト、気孔または創傷などの自然の開口部を通って入る5。アポプラスト内に入ると、 P. syringae はIII型分泌系(T3SS)とIII型転座エフェクター(T3E)に依存して植物の免疫を抑制し、病原体の利益のために植物の細胞機能を操作します6。T3SSおよびT3Eの発現は、標的遺伝子のプロモーター領域における hrp-box モチーフに結合する代替シグマ因子であるマスターレギュレーターHrpLに依存する7。
染色体に位置する転写融合を目的の遺伝子の下流にある蛍光タンパク質遺伝子に生成することにより、単一細胞レベルで放出される蛍光レベルに基づいて遺伝子発現をモニターすることができます8。この方法を使用すると、hrpLの発現は、実験室で増殖した細菌培養物内および植物アポプラストから回収された細菌集団内の両方で不均一であることが確立されました8,9。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、通常、実験室培地で増殖した細菌培養物で行われますが、このような解析は、植物内で増殖する細菌集団に対しても実施できるため、自然界での亜集団の形成に関する貴重な情報が得られます。植物から抽出された細菌集団の分析の潜在的な制限は、アポプラストへの注射器圧浸潤による古典的な接種方法、それに続く葉組織の浸軟による細菌抽出が、典型的には、下流の分析を妨げる大量の細胞植物残渣を生成することである10。ほとんどの細胞破片は、GFP蛍光と重なる葉緑体の自己蛍光断片で構成されており、誤解を招く結果をもたらします。
本プロトコルは、2つのモデル病理系における単一細胞遺伝子発現不均一性を分析するプロセスを記載している: P. syringae pvによって形成されるもの。トマト株DC3000と シロイヌナズ ナ(Col-0)、その他は P. syringae pvによる。ファセオリコラ株1448Aおよび豆植物(フェイセオラス・ブルガリス 品種カナディアンワンダー)。真空チャンバーとポンプを用いた真空浸透に基づく接種方法を提案し、葉全体を迅速かつダメージフリーに浸透させる方法を提供します。さらに、従来のプロトコルの改善として、注射器内の少量の容量を使用して正負の圧力のサイクルを適用することによるアポプラストの抽出に基づいて、組織破壊を大幅に減少させるより穏やかな方法を使用して、組織破壊を大幅に減少させます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示する方法は、植物の葉面組織への細菌の浸潤を可能にし、組織の破壊を最小限に抑えながら大量の迅速な接種を可能にする非侵襲的手順を説明しています。 P. syringae 種複合体の特徴の1つは、着生植物として植物のアポプラストの内部および植物表面で生き残り増殖する能力です14。したがって、本プロトコルを使用して抽出された細菌が植物のアポプラス…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033/が資金提供するプロジェクトグラントRTI2018-095069-B-I00と「ERDP A way of make Europe」の支援を受けました。J.S.R.は、Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación(PAIDI 2020)から資金提供を受けました。N.L.P.は、Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e InnovaciónのProject Grant P18-RT-2398によって資金提供されました。
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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