Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal
Summary
El presente protocolo describe un método que permite el análisis de expresión génica unicelular en poblaciones de Pseudomonas syringae cultivadas dentro del apoplasto vegetal.
Abstract
Una gran cantidad de microorganismos patógenos atacan constantemente a las plantas. El complejo de especies de Pseudomonas syringae engloba bacterias fitopatógenas gramnegativas de especial relevancia para un amplio número de hospedadores. P. syringae entra en la planta desde la superficie de la hoja y se multiplica rápidamente dentro del apoplasto, formando microcolonias que ocupan el espacio intercelular. La expresión constitutiva de proteínas fluorescentes por parte de las bacterias permite la visualización de las microcolonias y el seguimiento del desarrollo de la infección a nivel microscópico. Los avances recientes en el análisis de células individuales han revelado la gran complejidad alcanzada por las poblaciones bacterianas isogénicas clonales. Esta complejidad, conocida como heterogeneidad fenotípica, es la consecuencia de las diferencias de célula a célula en la expresión génica (no vinculadas a diferencias genéticas) entre la comunidad bacteriana. Para analizar la expresión de loci individuales a nivel de una sola célula, se han utilizado ampliamente fusiones transcripcionales a proteínas fluorescentes. Bajo condiciones de estrés, como las que ocurren durante la colonización del apoplasto de la planta, P. syringae se diferencia en distintas subpoblaciones basadas en la expresión heterogénea de genes clave de virulencia (es decir, el sistema de secreción Hrp tipo III). Sin embargo, el análisis unicelular de cualquier población dada de P. syringae recuperada del tejido vegetal es un desafío debido a los desechos celulares liberados durante la interrupción mecánica intrínseca a los procesos de inoculación y extracción bacteriana. En el presente informe se detalla un método elaborado para vigilar la expresión de los genes de P. syringae de interés a nivel unicelular durante la colonización de Arabidopsis y plantas de frijol. Se describe la preparación de las plantas y las suspensiones bacterianas utilizadas para la inoculación mediante una cámara de vacío. La recuperación de bacterias endófitas de hojas infectadas por extracción de fluido apoplástico también se explica aquí. Tanto la inoculación bacteriana como los métodos de extracción bacteriana están optimizados empíricamente para minimizar el daño de las células vegetales y bacterianas, lo que resulta en preparaciones bacterianas óptimas para el análisis de microscopía y citometría de flujo.
Introduction
Las bacterias patógenas muestran diferencias en diversos fenotipos, dando lugar a la formación de subpoblaciones dentro de poblaciones genéticamente idénticas. Este fenómeno se conoce como heterogeneidad fenotípica y ha sido propuesto como una estrategia de adaptación durante las interacciones bacteriano-huésped1. Los avances recientes en la resolución óptica de microscopios confocales, citometría de flujo y microfluídica, combinados con proteínas fluorescentes, han fomentado el análisis unicelular de poblaciones bacterianas2.
La Pseudomonas syringae gramnegativa es una bacteria patógena vegetal arquetípica debido a su importancia académica y económica3. El ciclo de vida de P. syringae está ligado al ciclo del agua4. P. syringae entra en los espacios intercelulares entre las células mesófilas, el apoplasto de la hoja de la planta, a través de aberturas naturales como estomas o heridas5. Una vez dentro del apoplasto, P. syringae se basa en el sistema de secreción tipo III (T3SS) y los efectores translocados tipo III (T3E) para suprimir la inmunidad de la planta y manipular las funciones celulares de la planta en beneficio del patógeno6. La expresión de T3SS y T3E depende del regulador maestro HrpL, un factor sigma alternativo que se une a los motivos hrp-box en la región promotora de los genes diana7.
Al generar fusiones transcripcionales localizadas en cromosomas a genes de proteínas fluorescentes aguas abajo del gen de interés, se puede monitorear la expresión génica en función de los niveles de fluorescencia emitidos a nivel de una sola célula8. Utilizando este método, se ha establecido que la expresión de hrpL es heterogénea tanto dentro de cultivos bacterianos cultivados en el laboratorio como dentro de poblaciones bacterianas recuperadas de la planta apoplast 8,9. Aunque el análisis de la expresión génica a nivel unicelular se realiza típicamente en cultivos bacterianos cultivados en medios de laboratorio, tales análisis también pueden llevarse a cabo en poblaciones bacterianas que crecen dentro de la planta, proporcionando así información valiosa sobre la formación de subpoblaciones en el contexto natural. Una limitación potencial para el análisis de poblaciones bacterianas extraídas de la planta es que los métodos clásicos de inoculación por infiltración de presión de jeringa en el apoplasto, seguidos de extracción bacteriana por maceración del tejido foliar, típicamente generan una gran cantidad de restos celulares de plantas que interfieren con el análisis aguas abajo10. La mayoría de los desechos celulares consisten en fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se superponen con la fluorescencia GFP, lo que resulta en resultados engañosos.
El presente protocolo describe el proceso de análisis de la heterogeneidad de la expresión génica unicelular en dos patosistemas modelo: el formado por P. syringae pv. cepa de tomate DC3000 y Arabidopsis thaliana (Col-0), y la otra por la P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A y plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Se propone un método de inoculación basado en la infiltración al vacío utilizando una cámara de vacío y una bomba, lo que resulta en un método rápido y sin daños para infiltrar hojas enteras. Además, como mejora de los protocolos convencionales, se utiliza un método más suave para extraer la población bacteriana del apoplast que reduce significativamente la alteración tisular, basado en la extracción de líquido apoplástico mediante la aplicación de ciclos de presión positiva y negativa utilizando una pequeña cantidad de volumen dentro de una jeringa.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado aquí describe un procedimiento no invasivo que permite la infiltración de bacterias en el tejido foliar de la planta, lo que permite la inoculación rápida de grandes volúmenes y minimiza la interrupción del tejido. Una de las características del complejo de especies de P. syringae es la capacidad de sobrevivir y proliferar dentro del apoplasto de la planta y en la superficie de la planta como epífita14. Por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de qu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto RTI2018-095069-B-I00 financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ y por “ERDP A way of making Europe”. J.S.R. fue financiado por el Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. fue financiado por la Subvención del Proyecto P18-RT-2398 del Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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